疟疾、登革热、丝虫病、黄热病等以蚊虫为媒介的重大传染疾病严重威胁人类的健康，蚊媒防治是控制和消除这些疾病的有效手段。传统的蚊媒防治以化学药剂为主，但抗药性以及化学药剂对环境的污染和生态破坏等问题日益严重。分子生物学的发展为蚊媒的防治提供了新的途径，其中以昆虫遗传修饰技术与昆虫不育技术( Sterile insect technique，SIT) ( Knipling， 1970) 相结合发展起来的昆虫遗传修饰不育技术为害虫防治提供了新的思路。通过在媒介种群中引入携带显性致死基因或病原体抗性基因等害虫控制效应基因的人工品系，能够有效降低目标种群的数量或进行种群替代，从而阻断蚊媒对病原微生物的传播( 周秀娟等， 2008; Catterucciaet al.， 2009; Klassen，2009; Wilke & Marrelli，2012) 。近年来，蚊媒昆虫的遗传修饰不育技术研究发展迅速，相关品系在世界各地被广泛使用并取得了较好的效果，表明其在蚊媒疾病的防控中具有巨大的应用潜力( Catteruccia et al. ，2009; Wilke& Marrelli，2012) 。

1 蚊虫遗传防治的历史

SIT 是指通过释放辐照( Irradiation) 等处理的雄虫与野生型雌虫交配，使其不育从而降低目标昆虫种群数量的一种害虫控制技术( Knipling， 1970) ，其具有物种特异、环境友好、可工厂化生产、大面积控制等特点( Hendrichs et al. ，2002) 。SIT 在蚊媒防治中的应用已有较长的历史( 表1; Benedict &Robinson， 2003) 。获得不育昆虫的手段除了辐照不育以外，还包括化学不育( Chemosterilization，Ch) 、胞质不亲和性( Cytoplasmic incompatibility，CI) 、杂交不育( Hybrid male sterility，Hy) 、减数分裂驱动( Meiotic drive) 、染色体移位和重排( Chromosomaltranslocation and rearrangements，Tr) 等，其中以辐照不育应用最为广泛( Benedict & Robinson， 2003) 。

　　2 蚊子遗传防治的主要策略

　　2. 1 种群压制种群压制是通过降低一定区域内目标媒介蚊虫种群数量来控制蚊媒疾病的传播，该策略与化学药剂的目的类似，但是避免了杀虫剂抗性、杀伤非目标昆虫、环境污染等问题，这一策略的主要代表手段包括传统SIT、释放携带显性致死基因昆虫的技术( Release of insects carrying a dominant lethal，RIDL) 、X 或常染色体连锁的归巢内切酶基因( Homing endonuclease gene，HEG) 系统、不相容昆虫技术( Incompatible insect technique， IIT) 、致死—拯救( Killer-Rescue) 系统、多位点混合( Multi-locus assortment，MLA) 等。在种群压制策略中，必须通过周期性释放来保证效应基因在目标种群中的扩散和基因频率的提高。SIT 是蚊虫种群压制策略中应用最广泛的是害虫防治手段之一( Alphey，2014) ，但该技术也存在一些难以克服的缺点，特别是γ 射线等在诱导雄蚊不育的同时降低了其野外适合度( Scolari et al.， 2008; Thomas et al.， 2000) 。而基于转座子活性和性别决定系统发展起来的RIDL 和fsRIDL( female-specific RIDL) ( Alphey，2014; Heinrich& Scott，2000; Thomas et al. ，2000) ，能够释放携带条件致死基因纯合子品系( Homozygousstrains) 的雄蚊，该纯合子品系与野生型雌蚊交配后，雌性后代在特异致死基因作用下死亡，而雄性后代继续携带致死基因与野生型雌虫交配，引起目标种群数量的减少，连续释放后甚至能根除种群，从而阻断蚊媒对病原微生物的传播( Catteruccia etal.， 2009; Klassen，2009; Wilke & Marrelli，2012) 。与传统SIT 相比，RIDL 对蚊虫交配和野外生存适合度的损伤低，且免去了不育处理的环节， fsRIDL 甚至不需要性别筛选，这为致死基因作用时间的选择提供了更大的灵活性( Phuc et al.， 2007; Thomas et al.， 2000) ，大大节省了人力和物力，具有更高的遗传控制效率( Alphey et al.， 2011; Black et al.， 2011) 。HEG 驱动系统主要利用HEG 酶能够定向识别插入在染色体上特定两段DNA 序列之间的特点，当两条同源染色体中一条具有HEG 基因时，HEG酶将切割另一条染色体，并以前者为模板进行复制，即homing 现象( Sinkins & Gould，2006) 。由于归巢内切酶I-PpoI 对与X 染色体连锁的28S 核糖体基因的重复序列高度特异性靶定( Nolan et al. ，2011) ，当其与雄虫X 染色体靶定时，可以在精子发生过程中切割X 染色体导致后代雌性不存活或不产生X 型精子; 与常染色体靶定时会导致fsRIDL;而当其与Y 连锁则后代所有雄蚊均带有该基因，从而在减数分裂驱动下扩散( Burt，2003; Catterucciaet al. ，2005; Deredec et al. ，2008; Windbichler etal.， 2011) 。而IIT 则利用了昆虫内共生菌Wolbachia的胞质不相容性( Cytoplasmic incompatibility，CI) ，将携带Wolbachia 的雄蚊与不携带或携带不同类型Wolbachia 的雌蚊交配，诱导产生胞质不相容性，其后代在胚胎期死亡; 而含同种类型Wolbachia的雌雄蚊交配产生的后代可正常发育并感染沃尔巴克氏体，从而使携带该Wolbachia 的品系在野生种群中迅速扩散，最终降低靶标昆虫的数量( Alphey，2014; Hancock & Godfray，2012; Laven， 1967;O’Connor et al.， 2012; Werren et al.， 2008; Zabalouet al.， 2004、2009) 。

　　2. 2 种群替代种群替代是指将能够传播病原物的蚊虫品系替换为无法致病的品系( Alphey，2014) ，其主要代表技术包括显性不足( Underdominance，UD) 技术、Wolbachia 驱动系统、Medea 元件驱动系统、转座子( Transposons) 转化系统、Y 染色体连锁的HEG 驱动系统等。在种群替代策略中，效应基因能够在目标种群中自主扩散。蚊媒、病原微生物、抗性基因和基因驱动系统之间复杂的进化关系是种群替代策略研究的核心环节。目前已知的Wolbachia 驱动系统、Medea 驱动系统、转座子转化系统、显性不足技术、HEG 等均能促进蚊媒抗性的产生( Alphey，2014; Chen et al.， 2007; Moreira et al.， 2009) 。转座子是基因组中能自主复制和移位的DNA区段，广泛存在于昆虫基因组，不过大多数转座子已发生突变不表现活性。目前，转座子已被广泛应用于分子生物学研究。转座子在染色体不同位点的插入有可能导致外源基因失活或染色体重排，进而使蚊虫的适应性下降。来自粉纹夜蛾Trichoplusia ni 的piggyBac 转座子能特异识别TTAA 位点，并准确切除与插入外源基因，可转入的外源基因的大小几乎不受限制，也无物种限制，是遗传修饰系统中应用最广泛的转座子之一( Fraser et al. ，1983; Handler，2002) ，目前应用piggyBac 转座子已成功获得了蚊媒的多个遗传转化品系( Fu et al.， 2010; Phuc et al. ，2007; Wise et al.， 2011) 。此外，研究者也将Hermes( Jasinskiene et al. ，1998; Zhao & Eggleston，1998) 、Minos ( Catteruccia et al. ，2000a、2000b ) 、Mariner( Coates et al.， 1998) 等转座子抗性基因成功转入蚊虫的细胞系或得到遗传修饰品系。由于大部分非蚊虫来源的转座子在蚊虫中的遗传转化成功率较低，给其应用带来了一定的局限性( O’Brochta et al. ，2003) ，因此需要挖掘蚊媒自身位点特异且非连锁的转座子( Rasgon & Gould，2005) 。Arensburger et al.( 2005) 已在冈比亚按蚊Anopheles gambiae 中发现了Herves 转座子，但其调控机制尚不明晰。内生菌Wolbachia 能够通过增强蚊虫的自身免疫力或改变蚊虫的代谢通路等方式( Brennan etal.，2008; Pan et al. ，2012) ，诱导蚊媒对病原微生物的抗性( Bian et al. ，2010、2013; Moreira et al. ，2009) ，抑制甚至清除病原微生物的感染( Walker etal.，2011) 。将抗病的蚊虫释放于靶标蚊媒种群中引起胞质不相容性，抗性Wolbachia 逐步扩散到靶标种群中，进而取代易感靶标蚊媒，从根源上控制了蚊媒病的传播。基于赤拟谷盗Tribolium castaneum的Medea 元件也能辅助蚊媒对病原微生物抗性的产生( Chen et al.，2007) ，Medea 元件由母系特异启动子驱动的对胚胎有毒性的RNA 或蛋白和受精卵特异的启动子驱动解毒蛋白组合在一起。由于雌性杂合子后代均具有母系遗传的毒素基因，当后代未遗传到解毒基因时将死亡，当遗传到母/父系来源的解毒基因时将存活( Alphey， 2014) 。通过染色体易位等遗传操作产生的显性不足( Curtis， 1968; Davis et al.， 2001;Magori & Gould，2006) 和Y 染色体连锁的HEG( Alphey，2014; Burt， 2003; Catteruccia et al.， 2005; Deredecet al.， 2008) 也能驱动种群替代。不同种群替代技术的驱动效率不同，驱动效率较低的Wolbachia 系统和显性不足系统需要更多的初始释放数量，而驱动效率较高的转座子系统和HEG 需要的初始释放数量则相对较低( Alphey， 2014) 。

　　3 RIDL 技术

　　3. 1 RIDL 技术原理和现有品系基于tet-off 系统调控效应基因的表达是目前RIDL 技术实现蚊虫特异性致死的最主要方式。在tet-off 系统中，当大肠杆菌Escherich coli 的转座子Tn10 的四环素阻遏因子( tetracycline repressor，tetR) 与四环素结合时， tetR 不能阻抑四环素抗性操纵子( tetracycline-resistance operon， tetO) ，因此下游转录不受抑制。将tetR 的部分序列与单纯疱疹病毒VP16 的转录活性区段组合为四环素转录激活因子( tetracycline transcriptional activator， tTA) ， tTA 与性别/组织/发育阶段特异性启动子构建为tet-off驱动载体， tetO 与CMV 启动子构成四环素响应元件( Tetracycline response element，TRE) ，TRE 与效应基因组合成效应载体，进而组建为完整的tet-off表达系统( Gossen & Bujard， 1992) 。在缺乏四环素时， tTA 与tetO 结合引发效应基因表达; 但在饲养条件存在四环素时， tTA 与四环素结合而不与tetO结合，无法激活下游效应基因的表达。

　3.2　通过特定遗传标记筛选转化品系是RIDL 构建过程中的关键步骤，利用不同启动子驱动荧光标记是目前的常用手段。优良的启动子—荧光基因表达模式能够大大降低转化筛选的难度，在提高RIDL 品系构建效率的同时，有助于释放品系的后期监测。组成型启动子通常具有表达强度高、表达周期长和表达面积大的优点，英国Oxitec 公司采用组成型启动子Hr5-IE1 构建了性能良好的遗传荧光标记，全身表达DsRed2 或GFP 的埃及伊蚊Aedesaegypti 幼虫在荧光滤镜下清晰可见( 图1A) ; 而表达Hr5IE1-DsRed2 的幼虫肛乳头呈现出斑点荧光模式，主要是来自核位点的荧光信号( 图1B) 。此外，3xP3 启动子也常常用于构建蚊子的遗传荧光标记，以驱动如AmCyan( 图1C) 或DsRed( 图1D) 荧光基因在埃及伊蚊光学神经中的表达。目前开发的蚊子RIDL 品系主要来自Oxitec 公司，目标物种包括埃及伊蚊、白纹伊蚊Aedes albopictus和冈比亚按蚊等，有的品系已经进入田间释放阶段( 表2) 。Phuc et al. ( 2007) 通过模型研究发现，由于存在密度依赖效应，携带晚期表达效应基因的RIDL 品系与早期品系相比，不仅能够大大减少释放的初始虫源数量，而且能更快地达到控制种群的目的，具有更好的防治效果; 通过构建埃及伊蚊RIDL 品系LA513A( OX513A) 进行验证，在此系统中tTA 通过反复结合tetO 而不断积累，最终达到致死剂量; 由于tTA 既是转录激活因子，也是效应基因，该体系被称作单元件系统( Gong et al. ，2005) 。

　　此外，Fu et al. ( 2010) 将雌蚊飞行肌特异性启动子AeAct-4 ( Muoz et al. ，2004) 与tTA 元件连接构建tet-off 驱动载体，将细胞凋亡基因Nipp1Dm 和michelob_x 与TRE 连接构建效应载体，将驱动品系OX3545 分别与效应品系OX3547 和OX3582 杂交，获得的雌性后代在四环素缺乏时引发效应基因在飞行肌的特异性表达，从而丧失了飞行能力成为无翅型，比例高达65. 8% ～ 98. 3%，而雄蚊则不受影响; 该体系既需要表达tTA 的驱动载体，也需要表达致死基因的效应载体，因此又称作双元件系统( Alphey et al. ，2008) 。同时，Fu et al.( 2010) 利用AeAct-4 启动子构建了单元件系统并得到了OX3604C 品系，当不存在四环素时，过量表达的tTA 导致飞行肌细胞凋亡，后代雌蚊几乎全部无翅，而雄蚊则不受影响。飞行能力对蚊子营养获取、交配及逃生等至关重要( Labbé et al.，2012) ，因此OX3604C 实质上等同于基于tet-off 调控下的雌性特异致死品系。Wise et al. ( 2011) 调查了埃及伊蚊OX3604C 品系雄蚊用于SIT 的潜力，实验室条件下当以遗传修饰雄蚊∶ 野生型雄蚊= ( 8. 5 ～ 10) ∶ 1，每周释放1 次时， 10 ～ 20 周便可压制野生型蚊虫。Labbé et al. ( 2012) 采用白纹伊蚊的AealbAct-4 启动子构建了RIDL 品系OX4358 并取得了与OX3604C近似的结果，表明Actin-4 启动子的雌性飞行肌特异活性可能在不同蚊子种类中保守。