小型猪因其体型大小、解剖结构、代谢特点、生理生化等方面与人有较大的相似性，近年来越来越广泛地被用于生物医学研究，而各种转基因猪更大大扩展了小型猪在生物医学研究中的应用范围。西藏小型猪是本单位2004 年由西藏自治区引种至广州培育而成的实验小型猪品种，近年来，应用其建立了数种转基因动物模型[1 – 2]。制备转基因克隆猪常用的猪胚胎成纤维细胞( porcine embryonic fibroblasts，PEFs) 是取自猪35 日龄胚胎的原代成纤维细胞，将外源基因导入PEFs是制备转基因克隆猪的第一步[3]。目前常用的将外源基因导入PEFs 的方法有脂质体转染法与慢病毒介导的方法。但是脂质体法转染PEFs 的转染效率很低，通过较长时间的药物筛选才能获得少量的稳定表达转基因的细胞用于后期的核移植; 而慢病毒法能解决转染效率低的问题，但是慢病毒生产存在一定的技术难度且操作较直接的质粒转染要复杂，而且对于片段较大的质粒，慢病毒感染的效率会下降。Nucleofection 核转染技术是一种可以针对不同细胞类型，选择最佳的转染程序与转染试剂的电转染技术，利用这种方法可以高效转染难转染的细胞系和原代细胞( 如神经元、免疫细胞、干细胞等) [4]，且转染效率较高，因其操作便利性与较高的转染效率，目前已经有一些实验室将此技术应用到转基因克隆猪制备的上游工作( 将目的基因转入PEFs) 。本实验室参照已报道的实验条件，将此技术用于转染西藏小型猪PEFs，并比较其与传统脂质体转染方法在转染效率上的差别。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料与试剂

　　1. 1. 1 核转染用试剂与仪器核转染试剂: Human Dermal FibroblastsNucleofector Kit ( VPD-1001) ( 包含pmaxGFP 质粒)( 德国Lonza 公司) ; Nucleofector II 核转染仪( 德国Lonza 公司) 。

　　1. 1. 2 主要试剂胎牛血清、高糖DMEM、非必需氨基酸、L-谷氨酰胺购自Hyclone 公司、LipofectamineTM 2000、Opti-MEM、青霉素-链霉素溶液、胰蛋白酶和DMSO 等购自Invitrogen 公司，培养瓶及培养板等购自Corning公司。其余试剂为国产或进口化学纯或分析纯。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 借助Nucleofector 核转染仪将pmaxGFP 质粒转染入PEFs实验采用本实验室冻存的西藏小型猪PEFs，将冷冻保存的细胞复苏后传代2 次，胰酶消化收集细胞，并计数，用VPI-1001 试剂盒中的核转染液重悬细胞( Basic Nucleofector Solution + Supplement 4. 5:1) ，按106 细胞加5 μg 的量加入pmaxGFP 质粒，将混合液加入电转杯，使用U020 程序进行电转染，完成电转染后，尽快用吸管向电转杯中加入500 μL 预热的培养基，用吸管将细胞混合液转移到含足量预热培养液的培养瓶中，放入CO2培养箱培养一段时间后，观察细胞的绿色荧光蛋白( GFP) 表达情况。

　　1. 2. 2 借助脂质体将pmaxGFP 质粒转染入PEFs同期培养的PEFs，按照Invitrogen 推荐的实验方法，按每六孔板一个孔加2. 1 μg 质粒，5. 4 μL 脂质体的量进行转染。

　　2 结果

　　核转染5 h 后，倒置荧光显微镜下可见GFP 表达，转染效率在80%以上，转染3 d 后可见绿色荧光强度明显升高，转染效率也保持在80% 以上( 彩插11 图1) ，细胞生长迅速，活力良好。经过传代培养，发现转染6 d 后，GFP 阳性的细胞明显减少( 50%以下) ，伴随荧光亮度减弱。转染11 d 与21 d后，GFP 阳性的细胞进一步减少，但直到第21 天，可以看到P5 代细胞仍有少量细胞表达绿色荧光( 彩插11 图1) 。说明通过核转染可以获得少量稳定整合外源基因的细胞; 而用脂质体转染的PEFs，在12h 才可看到GFP 表达，且转染效率很低( 彩插11 图2) ，在传代培养至第7 天时，已经不可见绿色荧光。使用本实验中的核转染方法转染PEFs，所获得的转染效率明显高于脂质体法。

　　3 讨论

　　脂质体法只能介导外源基因的瞬时表达，仅有非常少量的细胞稳定整合了外源基因，需要通过新霉素( NEO) 、潮霉素( HYG) 等抗性基因来筛选稳定整合的细胞，而对于PEFs 这种原代细胞来说，本身脂质体转染的效率就很低( 10% 以下) ，再加上长达一周的抗生素筛选，使细胞活力大大下降，用这种方法筛选稳定整合目的基因的细胞株耗时很长，且获得转基因细胞的成功率低。Lonza 公司研发的核转染技术是一种非病毒介导的新型转染技术，该技术在传统电穿孔技术的基础上进行改良，设计出包含针对不同类型细胞的优化转染程序和细胞特异性核转染试剂。核转染法就是采用对特定类型细胞配套的核转染试剂和转染程序，直接把外源基因导入细胞核中，以达到最佳转染效率。与脂质体法相比，Nucleofection 核转染的方法可以将质粒DNA 直接转入细胞核内，从而__大大增加了质粒DNA 整合到宿主基因组的几率，因此能大大提高稳定整合的效率。Nucleofector 核转染仪需要针对不同细胞制定最佳的转染试剂和转染程序，从生产厂家Lonza 的网站上可以查到不断更新的用户更新的数据，包含近1000 种细胞的转染试剂、转染程序、优化实验方法、转染效率、细胞活性等信息。但是对于PEFs 我们在其网站没有查到相关信息。而国内崔茂盛[5]、李松[6]等分别对羊和牛的胚胎成纤维细胞进行了核转染，他们通过筛选多种转染程序发现针对羊胚胎成纤维细胞的最佳转染程序是T016，获得的转染效率为86%; 针对牛胚胎成纤维细胞的最佳转染程序是V013，获得的转染效率为96%。国外Maurisse等[7]发现，针对PEFs 的最优转染程序为U020 ( 猪种未提及) ，获得的转染效率是90%，他们使用的转染试剂是Human Dermal Fibroblasts Nucleofector Kit( VPD-1001) 。Nakayama 等[8] 转染Clawn 小型猪PEFs 时对推荐的10 个转染程序进行筛选得出最优程序U023，获得了79%的转染效率，使用的转染试剂是Basic Primary Fibroblasts Nucleofector Kit ( VPI-1002) 。

　　本实验我们采用Maurisse 的经验，使用VPD-1001 转染试剂和U020 程序，参考成纤维细胞的推荐实验方法对西藏小型猪PEFs 进行核转染。利用Nucleofection 核转染技术转染西藏小型猪PEFs 后，目的基因GFP 能在PEFs 中表达，获得了较高的转染效率，转染效率明显高于脂质体法转染PEFs，且传代21 d 后，仍有部分细胞表达GFP，说明通过Nucleofection 核转染能获得一定比例的稳定整合外源基因的细胞，预示可以通过此方法，再进行抗性筛选，获得稳定整合目的基因的细胞株，进而为制备转基因克隆猪提供核供体。Nucleofection 核转染技术操作简单，转染时无需更换无血清培养基，细胞在进行转染5 h 后即可看到荧光表达; 而脂质体转染法，转染时需要更换无血清培养基，转染后4 ～ 8 h 需要换液，以去除其对细胞的毒性，且一般于12 h 后才能看到荧光表达，可见，用核转染的方法，能大大减少实验操作，缩短实验周期，适合高通量的细胞转染实验。综上所述，Nucleofection 核转染的方法具有很多脂质体法不可比拟的优点，是一种高效转染猪PEFs的方法，值得推广应用。