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　　相对和绝对定量的等量异位标签( isobaric tagsfor relative and absolute quantitation，iTRAQ) 是由美国ABI 应用生物系统公司研发的一种多肽体外标记技术。iTRAQ 标记联合质谱分析，因其具有分离能力强、分析范围广、定性分析结果可靠、灵敏度高等优点现已成为差异蛋白质组学定量研究的主要工具之一。自推出以来，已被广泛应用于生命科学蛋白质研究的诸多领域。精原干细胞( spermatogonialstem cells，SSCs) 是位于睾丸生精小管基膜上既具有自我更新潜能，又具有定向分化潜能，可分化形成精子并将基因传递至子代的雄性生殖干细胞[1]，在维持雄性个体生育力及物种繁殖方面具有重要的作用。本研究首次在国内外采用以iTRAQ 为基础的蛋白组学研究方法，联合高效液相色谱-电喷雾串联质谱法( LC-ESI-MS /MS) ，动态观察不同年龄段的C57BL /6 小鼠SSCs 蛋白质组学表达差异，进一步分析这些蛋白质，从而获得SSCs 不同蛋白标志物在随小鼠年龄变化表达的差异，发现新的蛋白质或标记物，为进一步研究与应用SSCs 提供帮助。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料以健康雄性C57BL /6 小鼠为研究对象，实验小鼠由宁夏医科大学SPF 级实验动物中心提供。实验动物的处理符合宁夏医科大学动物保护和使用委员会的要求。

　　1. 2 主要试剂及仪器0. 25% 胰蛋白酶( 索莱宝公司) 、胶原酶( Sigma 公司) 、DNA 酶I( Worthington公司) 、CD90. 2 免疫磁珠、MS 免疫磁珠分选柱( 德国美天旎公司) 、40 μm 滤网( BD 公司) 、iTRAQ 标记试剂盒( ABI 公司) 、岛津LC-20AB 液相分离系统、串联ESI Q-EXACTIVE 质谱仪( Thermo Fisher 公司) 。

　　1. 3 方法

　　1. 3. 1 实验分组实验小鼠按照出生天数不同分组如下: 1 ～7 d、8 ～14 d、15 ～21 d、22 ～28 d、29 ～35 d、36 ～42 d、43 ～49 d、50 ～56 d，共8 组，每组10 只。

　　1. 3. 2 从组织中分离SSCs 取小鼠脱颈处死，75%酒精溶液浸泡消毒，剪开腹膜并暴露小鼠睾丸，剪下小鼠睾丸组织置于培养皿中，用PBS 液漂洗3次，去除血污。去除睾丸外白膜，将组织切成2 ～3 mm大小的组织块，采用两步酶法消化组织块。先用1 mg /ml 的胶原酶消化10 min，再用0. 25% 的胰蛋白酶+ EDTA + DNase I( 7 mg /ml) 消化10 min，消化过程在37 ℃水浴箱中进行，消化中每隔3 min摇动1 次。以胎牛血清终止消化，用40 μm 滤网滤掉尚未充分消化的组织块，以计数板计数细胞浓度。

　　1. 3. 3 免疫磁珠分选SSCs 事先配好分选缓冲

　　液，准备碎冰，以下所有操作均在4 ～ 8 ℃环境中完成。将上述制备的单细胞悬液加入缓冲液清洗细胞，离心( 300 g， 10 min，4 ℃) 后加入缓冲液重获单细胞悬液，再次用40 μm 的滤网过滤，细胞计数离心后去掉上清，加入80 μl /107 个细胞的缓冲液和20 μl /107个细胞的CD90. 2 免疫磁珠，4 ℃ 混匀放置20 min。加入1 ml /107个细胞的缓冲液清洗细胞并离心，重悬细胞加入500 μl /108个细胞的缓冲液，准备好分离柱，并用缓冲液清洗，把细胞悬液倒入柱子中，用500 μl 的缓冲液冲洗柱子，共3 次。将柱子移开磁场，用1 ml 缓冲液冲洗，再次计数细胞并离心，所得沉淀即为SSCs，加细胞冷冻液后移入冷冻管中，- 80 ℃保存并记录。

　　1. 3. 4 蛋白提取、定量与电泳称取适量的样品，加入蛋白裂解液溶解，分别添加终浓度为1 mmol /L的PMSF、2 mmol /L 的EDTA，5 min 后添加终浓度10 mmol /L 的DTT。超声15 min，以25 000 × g 离心20 min，取上清。上清加入5 倍体积预冷丙酮，在- 20 ℃沉淀2 h，然后16 000 × g 离心20 min，弃上清。取适量沉淀，加入适量蛋白裂解液溶解，然后分别添加终浓度为1 mmol /L 的PMSF、2 mmol /L 的EDTA，5 min 后添加终浓度10 mmol /L 的DTT。超声15 min，然后25 000 × g 离心20 min，取上清。上清液在56 ℃条件下加入终浓度10 mmol /L DTT 处理1 h，以还原打开二硫键。再加入终浓度55 mmol /L IAM 暗室静置45 min，进行半胱氨酸的烷基化封闭。加入适量冷丙酮，在- 20 ℃静置2 h。25 000 × g 离心20 min，丢弃上清液。沉淀在200 μlTEAB( 0. 5 mol /L) 中超声溶解15 min。25 000 × g离心20 min 后取上清液用于Bradford 定量和SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳。

　　1. 3. 5 蛋白质iTRAQ 标记每个样品精确取出100 μg 蛋白。按蛋白∶ 酶= 20∶ 1 的比例加入胰蛋白酶，37 ℃ 酶解4 h，按上述比例再补加胰蛋白酶1次， 37 ℃继续酶解8 h。胰蛋白酶消化后，用真空离心泵抽干肽段，用0. 5 mol /L TEAB 复溶肽段，按说明书进行iTRAQ 标记，每1 组肽段随机被1 组iTRAQ 标签标记( 具体各组标记情况: 1W 113，2W 114，3W 115，4W 116，5W 117，6W 118，7W 119，8W 121) ，室温培养2 h，将标记后的各组肽段混合，用SCX 柱进行液相分离。

　　1. 3. 6 质谱分析与数据库检索经过液相分离的肽段进入到串联ESI 质谱仪。一级质谱分辨率设置为70 000，二级分辨率为17 500。扫描的质荷比范围为一级350 ～ 2 000，二级100 ～ 1 800。通过Mascot2.3. 02 蛋白质鉴定软件，选择已经建立好的Uniprot小鼠数据库，对鉴定到的蛋白进行分析。肽段匹配误差控制在0. 02 Da 以下。在相对定量时当蛋白的丰度比即差异倍数达到1. 2 倍以上，P < 0. 05，视该蛋白为不同样品间的差异蛋白。

　　1. 3. 7 标准生物信息学分析将检测到的蛋白通过GO 注释、COG 注释及Pathway 代谢通路注释，对其分子功能、所处的细胞位置、参与的生物过程等生物信息进行注释。通过差异蛋白的GO 富集分析、差异蛋白的Pathway 富集分析、多样品间表达模式聚类分析，对检索到的差异蛋白进行汇总分析。1. 3. 8 SSCs 标志物动态表达观察与新标志物筛选①通过检索国内外文献资料，总结目前已被广泛认可的SSCs 标志物，结合质谱测定数据，分析检测到的蛋白质在小鼠不同年龄阶段的动态表达情况。②通过蛋白质信息数据库将检测到的蛋白质与相关论文的研究结果进行比对，筛选目前未在SSCs 上进行验证的蛋白作为进一步研究的对象。

　　2 结果

　　2. 1 SSCs 免疫磁珠分选结果各组试验小鼠经无菌分离睾丸组织、两步酶法消化，过滤，免疫磁珠分选后富集到的SSCs 数量在3. 2 × 106 ～ 5. 4 × 106 个，富集后的细胞形态均一、完整( 图1) ，适合进一步研究操作。

　　2. 2 蛋白提取、定量及SDS 双向凝胶电泳结果各组蛋白经Bradford 法蛋白定量及SDS 双向凝胶电泳，从定量信息和电泳胶图上看( 图2) ，蛋白总量是满足酶解实验的，可以进一步进行质谱分析。2. 3 质谱分析蛋白质结果使用iTRAQ 技术进行蛋白质相对定量，用Q-EXACTIVE 质谱仪进行分析，共得到谱图248 510张，通过Mascot 软件进行分析后，匹配到的谱图数量是6 171张，其中Unique 谱图数量为5 440张，共鉴定到1 132 种蛋白，其中2 段以上不同肽段覆盖的蛋白460 种，占全部鉴定蛋白的40. 63%; 5 段以上不同肽段覆盖蛋白96 种，占全部鉴定蛋白的8. 48%。将鉴定到的蛋白定量信息经过两两对比，8组共检测到差异蛋白298 种( 图3) 。2. 4 标准生物信息注释对检测到的蛋白通过GO 注释( 图4) 、COG 注释( 图5) ，我们发现被检测到的蛋白分布于细胞膜的蛋白有364 种，分布于细胞器的蛋白有782 种，核蛋白13 种，其中参与细胞生物调节的蛋白有524 种，参与细胞代谢过程的有752 种，参与细胞信号传导的有690 种。通过差异蛋白的Pathway 富集分析及多样品间表达模式聚类分析( 图6) ，我们发现这些差异蛋白所涉及到的Pathway 达234 条，这些通路广泛参与细胞生命发展的各个环节，这为进一步研究这些蛋白在细胞生命活动中的功能及在SSCs 不同的时期起到的作用提供了指导和帮助。2. 5 SSCs 标志物动态表达观察与新标志物筛选本实验共检测到SSCs 标志物蛋白9 个，分别为PCNA[2]、GFRα1[3]、CDH1[4]、Annexin A7[5]、UCHL1[6]、VASA[7]、CD49f[8]、CD29[8]、PLZf[9]，通过将各组检测到的标志物丰度与第1 组的丰度进行比较，获得各标志物在1 ～ 8 周小鼠睾丸组织表达量的变化( 图7) ，我们发现这些蛋白质的表达存在年龄阶段差异性。我们将本试验结果与已发表的文献进行比对分析，发现CD49f、CD29、GFRα1 在不同时期SSCs的表达差异与文献[10-12]结果一致，其余6 个标志物尚未见相关文献报道有时相性表达差异。我们以CD90. 2 免疫磁珠对SSCs 进行分选后，通过质谱分析发现P63、CD71、CD98、K19、ACE、K18、K15、K17、SH2、SH3 在SSCs 中表达，这10 种蛋白质已发现为其他干细胞的标志物( 表1) ，是否能成为SSCs的标志物尚需进一步验证。3 讨论

正常小鼠出生后6 d 左右生精母细胞迁移至生精小管基膜，成为以SSCs 为主的精原细胞[1]，SSCs在维持雄性个体生育力及物种繁殖方面具有重要作用。自SSCs 移植技术建立以来，有关其分离、鉴定、培养及移植等方面的研究不断增多，使人们对其生物学特性有了更为深入的了解，为SSCs 的进一步研究与应用打下了坚实的基础。由于SSCs 在睾丸生精小管中分布较分散且数量稀少，在成年小鼠睾丸中SSCs 约占所有生精上皮细胞总数的0. 02% ～0. 03%[1]，如何获得高纯度、高活力的SSCs，是SSCs体外生物学研究及应用的关键所在。目前广泛采用的SSCs 提取方法有差速贴壁法、Percoll 密度梯度离心、流式细胞仪分选、免疫磁珠分选等，文献显示这几种方法均可从睾丸组织中分离富集出SSCs [26-30]，因MACS 操作简单、快捷、灵敏度高、分选后细胞活性高等特点目前被广泛采用。

研究表明MACS 分离细胞的纯度可达到95% 以上[31]。CD90( Thy1) 属于膜免疫蛋白超家族成员，全长约25 000 ～ 35 000，广泛表达于啮齿类、牛科、灵长类等动物SSCs 细胞膜上，并且据相关研究表明几乎所有的SSCs 均表现为CD90 + 特征[32]。CD90在鼠类体内主要以两种形式表达: CD90. 1( Thy1. 1)和CD90. 2( Thy1. 2) ，但CD90. 1 仅在部分大鼠体内表达( AKR/J、FVB /N、PL) ，而CD90. 2 表达于大部分鼠类( C57BL / -、DBA、NZB / -、Balb /c 等) 。Kubota 等[32]以CD90 为标志物通过免疫磁珠方法分别从青春期前及成年小鼠睾丸富集到5 倍和30倍的SSCs 细胞，Reding 等[33]以同样方法从青春期前小牛睾丸组织中分选SSCs，所分选出的细胞有85%具有干细胞特性。Abbasi 等[34]以同样的方法从3 ～ 4 周健康山羊睾丸组织中提取SSCs，SSCs 纯度增高了40 倍。

我们以C57BL /6 小鼠为研究对象，用CD90. 2 + 作为分选SSCs 的标志物，从各组分选结果可以看出CD90. 2 + 免疫磁珠能够成功从各年龄段小鼠睾丸中顺利分选目的细胞，所分选出的细胞在形态学上相似度较高，适合进一步比较与分析。本研究采用iTRAQ 联合LC-ESI-MS /MS 技术，共鉴定到1 132 种蛋白质，其中差异蛋白298 个，这些蛋白广泛参与细胞物质的合成与代谢、信号传导、细胞增殖及其调控、细胞分化与基因表达调控、细胞衰老与死亡等各项生命活动过程，进一步研究这些蛋白的功能将为深入了解SSCs 的增殖与分化过程起到重要的作用。通过数据分析我们初步筛选出作为进一步研究的SSCs 蛋白标志物10 个，其中P63、CD71、CD98 已被作为其他多种成体干细胞的标志物，提示这些蛋白在维持多种组织干细胞功能方面起着不可或缺的作用，同时也提示不同的成体干细胞在代谢、功能方面的相似性，为干细胞的研究提供了新的思路。我们通过iTRAQ 质谱分析技术共检测到1 132 种蛋白质，通过文献检索与比对，我们发现仍有部分标志物通过此分析技术尚未检测到。

综合分析，我们认为可能有以下原因: ①前期在SSCs分离时标志性蛋白被蛋白酶破坏了影响检测，在SSCs 分离时我们采用两步酶消化法将睾丸组织消化为单细胞悬液后进行免疫磁珠分选，虽然显微镜观察分选后的SSCs 形态均一，适合进一步研究，但不能排除细胞表面易降解的标志性蛋白被蛋白酶降解破坏的可能。②高丰度蛋白质干扰了低丰度蛋白质的检测和鉴定。③蛋白数据库筛选过程中存在误差，对于检测到的Unique 肽段，首先要经过蛋白质数据库进行信息比对，以确定其相对应的蛋白，在比对过程中可能由于部分蛋白所检测的Unique 肽段过少或与其他蛋白重叠，系统将其默认为其他蛋白，致使部分蛋白丢失。④以CD90. 2 + 免疫磁珠分选SSCs，所有获选SSCs 均阳性表达Thy1，而Thy1 表达阴性的SSCs 也可能同时表达其他标志物，这尚需进一步研究。虽然有诸多因素影响后期的检测结果，但本实验仍检测到较多种SSCs 所表达蛋白及年龄差异蛋白，其中被广泛认可的SSCs 标志物9 个。通过另一种手段发现这些标志物及其动态表达的变化，与以往文献报道结果相印证，进一步说明了这种方法在SSCs 蛋白质组学方面研究与应用的可行性和可信性，也为这些标志物在不同年龄段SSCs 中的应用提供了指导与帮助。总之， iTRAQ 标记的质谱分析技术为SSCs 蛋白质组学研究提供了安全、高效、可行的研究思路与方法，也为进一步研究SSCs 所表达蛋白在个体不同时期所起的作用提供了新的研究方向。通过本项研究我们一共检测到1 132 种蛋白及298 种差异蛋白，并检测到9 种动态表达标志物与10 种需要进一步验证的蛋白标志物，在后期的研究工作中我们会对这些蛋白在睾丸组织中的表达及功能进行进一步验证与分析，并对这些蛋白在不同时期SSCs 中所起的作用以及是否能确定成为临床有意义的标志物进行研究。__