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　　胃癌细胞的多药耐药性常常是导致化疗失败的主要原因。小RNA(microRNA，miRNA) 为调节基因转录的重要因子，miR-15b 和miR-16 在胃癌多药耐药SGC-7901 /VCR 细胞中低表达，通过上调miR-15b和miR-16，可靶向抑制抗凋亡蛋白Bcl-2，进而部分逆转细胞的多药耐药表型。Chen 等使用miRNA芯片检测结果表明，miR-1284 在胃癌淋巴结转移阳性组织比原发性胃癌组织表达少，但miR-1284 在胃癌细胞中的功能尚不清楚。本研究通过构建目的miR-1284 慢病毒，观察miR-1284 过表达后对人胃癌耐药SGC-7901 /VCR 细胞耐药性的影响，并探讨其可能的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1. 1 材料

　　miR-1284 基因过表达重组慢病毒颗粒由上海吉凯生物技术有限公司提供。CCK-8 试剂盒购自中国碧云天公司。异硫氰酸荧光素标记的膜联素Ⅴ/7-氨基放线菌素D( annexin Ⅴ-fluorescein isothiocyanate /7-aminoactinomycin D， annexin Ⅴ-FITC/7-AAD) 细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术有限公司。逆转录试剂盒及扩增试剂盒购自TaKaRa 公司。兔抗人Jagged1 抗体、兔抗人Notch1 抗体、兔抗人核因子κB(nuclearfactor κB，NF-κB) 抗体、兔抗人GAPDH 抗体均购自CST 公司，IRDye800 标记的山羊抗兔二抗购自Li-COR 公司。

　　1. 2 方法

　　1. 2. 1 细胞培养与瞬时转染用含100 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培养基，常规培养人GES-1 正常胃黏膜细胞。同样培养胃癌SGC-7901 /VCR 耐药细胞，并按照细胞耐药浓度800 ng /mL向其培养液中加入化疗药物长春新碱，以维持细胞耐药性。37℃、50 mL/L CO2饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞接种于6 孔板中，3. 5 × 104 个/孔，用不含抗生素和长春新碱、含200 mL/L 胎牛血清的RPMI1640 培养液培养。24 h 后，待细胞汇合度达40% ～ 60%时，按吉凯公司慢病毒转染说明书操作，将miR-1284 重组慢病毒颗粒( Lv-hsamiR-1284-gfp) 和对照慢病毒颗粒(Lv-gfp)分别感染人胃癌耐药SGC-7901 /VCR 细胞，作为实验组和阴性对照组，再设立一组不做任何处理的空白对照组细胞，常规培养。

　　1. 2. 2 实时荧光定量PCR 检测SGC-7901 /VCR 细胞中miR-1284的过表达采用TRIzol 法，提取GES-1 细胞株及胃癌耐药细胞株SGC-7901/VCR 各处理组细胞的总RNA 并检测RNA的纯度及浓度。逆转录和PCR 反应均严格按照TaKaRa 公司提供的说明书，以U6 作为内参进行相对定量，每组设3 个复孔，在Roche 实时定量荧光PCR 仪上进行检测。miR-1284 上游引物为5′-CGTCTATACAGACCCTGGCTTTTC-3’， 下游引物为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′; U6 上游引物为5′-TTATGGGTCCTAGCCTGAC-3’，下游引物为5′-CACTATTGCGGGTCTGC-3′; 采用2 -△△Ct法计算miR-1284 的相对表达量。

　　1. 2. 3 CCK-8 法检测细胞存活率取实验组、阴性对照组、空白对照组的对数生长期细胞，以3 × 103 个/孔接种到96 孔板中。设定长春新碱( vincristine，VCR) 浓度(0、200、400、800、1600、3200、6400) μg /mL，每组设立6 个复孔，每孔体积100 μL，将细胞培养板移入37℃、50 mL/L 的CO2培养箱中培养48 h; 每孔加入CCK-8 溶液10 μL，37℃、50 mL/L 的CO2培养箱中孵育1 h，使用酶联免疫检测仪在450 nm 波长处测定各孔吸光度值。各组各浓度复孔的平均值，计算细胞的存活率，再用Nosa 软件计算半数抑制浓度(50% inhibitoryconcentration，IC50)。

　　1. 2. 4 流式细胞术检测细胞周期取实验组、阴性对照组、空白对照组各组对数生长期细胞，弃去培养液，胰蛋白酶适度消化细胞。终止消化后1000 r /min 离心5 min，弃去上清液;用PBS 洗涤细胞2 次，加入4 mL 700 mL/L 冷乙醇，4℃固定12 h; 再用PBS 洗涤、重悬细胞并转至试管中，加RNase100 μL，37℃水浴箱中30 min。再加碘化丙锭(propidiumiodide，1242 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2015，31(9)DOI:10.13423/j.cnki.cjcmi.007461PI) 400 μL 染色混匀，4℃避光30 min，200 目尼龙网过滤后流式细胞仪检测。

　　1. 2. 5 流式细胞术检测细胞凋亡率取实验组、阴性对照组、空白对照组各组对数生长期细胞，弃去培养液，胰蛋白酶适度消化细胞。终止消化后，1000 r /min 离心5 min 收集细胞; 用PBS 洗涤细胞2 次，加入结合缓冲液悬浮细胞。加入annexinⅤ-FITC 混匀， 再加入7-AAD 混匀， 室温避光5 ～ 15 min，在1 h内进行流式细胞术检测。

　　1. 2. 6 生物信息学预测miR-1284 的潜在靶基因利用在线生物信息学软件Targetscan、miRDB 和microRNA 综合分析相关因素，筛选出目的miR-1284 可能的潜在靶基因。

　　1. 2. 7 Western blot 法检测人SGC-7901 /VCR 胃癌耐药细胞Jagged1、Notch、NF-κB 基因的蛋白水平用细胞裂解液提取各组细胞总蛋白，BCA 法测定蛋白含量。取各组蛋白100 μg，变性后进行100 g /L SDS-PAGE 并转移至PVDF 膜; 用TBST配制的50 g /L 脱脂牛奶封闭1 h，洗膜; 将载有不同蛋白的膜分别置入兔抗人Jagged1 抗体(1 ∶1000)、兔抗人Notch 抗体(1∶1000)、兔抗人NF-κB 抗体(1∶1000)、兔抗人GAPDH 抗体(1∶1000)，4℃摇床封闭过夜; 隔日洗膜后置入IRDye800 标记的山羊抗兔抗体(1∶10 000)，避光摇床1 h，再次洗膜后红外荧光仪曝光显影。显影后的图像用Quantity One 软件定量处理。

　　1. 2. 8 统计学分析应用SPSS16. 0 统计软件进行分析，计量资料采用x ± s 表示，计量资料2 组间比较采用t 检验，多组间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)，P < 0. 05为差异有统计学意义。

　　2 结果

　　2. 1 实时荧光定量PCR 检测

　　GES-1 细胞株和SGC-7901 /VCR 胃癌耐药细胞miR-1284 的表达量与正常GES-1 细胞相比，SGC-7901/VCR 胃癌耐药细胞miR-1284 表达增加，差异有统计学意义(P < 0. 05);以GES-1细胞为参照，SGC-7901 /VCR 细胞miR-1284的相对表达量为0. 83 ± 0. 01。空白对照组细胞miR-1284 的相对表达量为14. 85 ± 0. 01，Lv-gfp 转染的阴性对照组细胞miR-1284的相对表达量为14. 99 ±0. 17， Lv-hsa-miR-1284-gfp 转染的实验组细胞miR-1284 的相对表达量为9. 55 ± 0. 01。与空白对照组以及阴性对照组细胞比较，Lv-hsa-miR-1284-gfp 转染的实验组细胞miR-1284 表达减少，差异有统计学意义(P < 0. 05); 阴性对照组与空白对照组比较，两者之间差异无统计学意义(P > 0. 05)。以内参U6 为标准进行校正，应用2 -△△Ct 进行相对定量分析，miR-1284 在实验组的表达量分别是阴性对照组和空白对照组的(44. 06 ± 8. 28)倍和(39. 59 ± 1. 14)倍。

　　2. 2 miR-1284 转染SGC-7901 /VCR 胃癌耐药细胞抑制细胞生长

　　细胞抑制率随着VCR 水平的增加而增高，将其各浓度A 值进行比较， 差异有统计学意义(P < 0. 05)，可见随着化疗药物VCR 水平的增加，细胞死亡的数量越多。空白对照组IC50值为2595. 61，阴性对照组IC50值为2573. 35，实验组细胞的IC50值为2354. 84。与阴性对照组和空白对照组细胞相比， 转染Lv-hsa-miR-1284-gfp 实验组细胞的IC50值低，差异有统计学意义(P < 0. 05); 阴性对照组与空白对照组细胞比较，两者之间差异无统计学意义。

　　2. 3 miR-1284 转染的SGC-7901 /VCR 胃癌耐药细胞G0 /G1 期阻滞

　　与阴性对照组和空白对照组细胞相比，实验组的细胞G0 /G1 期的比例增加，差异有统计学意义(P < 0. 05); 而阴性对照组与空白对照组相比，差异无统计学意义(P > 0. 05)。细胞周期实验结果提示，稳定过表达miR-1284 的细胞出现G0 /G1期阻滞。

　　2. 4 miR-1284 转染的SGC-7901 /VCR 胃癌耐药细胞凋亡增加

　　与阴性对照组和空白对照组相比，实验组(Lv-hsa-miR-1284-gfp) 细胞凋亡率增加，差异有统计学意义(P < 0. 05); 而阴性对照组与空白对照组相比，差异无统计学意义

　　2. 5 靶基因预测结果

　　miR-1284 在Jagged1mRNA 的3′ 端非翻译区(3’untranslated regions，3’UTR)上有一个保守的靶位点，靶位点类型为7merm8，”context + score”百分位数为82，表明其与靶位点可能互补。

　　2. 6 miR-1284 过表达降低Jagged1、Notch 和NF-κB 水平

　　Western blot 结果表明，Lv-hsa-miR-1284-gfp 感染细胞的Jagged1、Notch、NF-κB 的蛋白表达量明显低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义(P < 0. 05); 而阴性对照组和空白对照组之间的Jagged1、Notch、NF-κB 的蛋白表达量无明显变化，差异无统计学意义(P > 0. 05)。说明miR-1284过表达可减少Jagged1、Notch、NF-κB 的水平。

　　3 讨论

　　miRNA 的上调或下调将阻滞相关靶基因的信号通路，从而导致肿瘤耐药性的改变。Chen 等的研究证实在胃癌耐药细胞中miRNA 发挥着一定的调节作用。Chen 等研究报道miR-1284 在胃癌淋巴结转移阳性组织比原发性胃癌组织表达少。此外，miR-1284 在全血miRNA 水平可能作为区分肺癌临床病例和相关控制的一个重要分级点。据此，我们推测miR-1284 在癌症的发生发展中可能发挥着一定作用。本研究证明: GES-1 人胃黏膜细胞的miR-1284表达量明显高于SGC-7901 /VCR 人胃癌耐药细胞空白组。我们通过构建miR-1284 基因转染SGC-7901 /VCR 人胃癌耐药细胞株来研究miR-1284 过表达对胃癌细胞耐药性的影响。结果表明，miR-1284 的过表达致耐药株IC50大幅度下降，细胞周期阻滞于G0 /G1期，及凋亡率明显升高。提示miR-1284 的上调能提高胃癌细胞对化疗药物的敏感性。为更好地了解miR-1284 逆转肿瘤耐药性的分子机制，我们通过Targetscan、miRDB 和miRNA 三个靶基因预测软件筛选出miR-1284 可能作用的下游靶基因为Jagged1。Jagged1 作为Notch 受体其中一个主要配体，通过与邻近细胞表面Notch 受体结合，启动Notch 信号通路。

　　本研究结果显示miR-1284过表达后，Jagged1 与Notch1 表达均降低，我们推测miR-1284 可能通过阻断Jagged1 进而导致Notch1 蛋白水平下降。Notch 水平下调后，肿瘤增殖能力下降，并被诱导凋亡。另一方面，Notch 下调也致头颈部鳞状细胞癌、胰腺癌、结肠癌、乳腺癌、卵巢癌、宫颈癌耐药1244 细胞与分子免疫学杂志(Chin J Cell Mol Immunol)2015，31(9)性发生逆转。D’Altri 等、Zang 等和Wang等的研究证明NF-κB 可能为Notch 下游基因，而且NF-κB 的变化也会调节Notch 的表达并进一步影响Notch 通路。研究表明，NF-κB 水平的下调能增加耐药胃癌细胞对药物的敏感性。据此，我们推测阻断Notch /NF-κB 通路能逆转肿瘤细胞的耐药性。我们的研究结果显示转染了miR-1284 的胃癌细胞Jagged1、Notch 及NF-κB 蛋白表达量匹配下降。研究结果结合生物信息学提示，Jagged1 可能是miR-1284 的直接靶基因，但仍需双萤光素酶报告基因的技术验证。

　　综上所述，本研究通过成功构建miR-1284 基因过表达的SGC-7901 /VCR 人胃癌耐药细胞株，证实miR-1284可能通过阻断Jagged1 /Notch1 /NF-κB 通路，提高胃癌患者对化疗药物的敏感性及改善预后，给胃癌的研究提供一个新的思路。