研究分析重组人精囊蛋白1 片段的原核表达及其对精子活率的影响
人精囊蛋白主要由精囊上皮细胞分泌，射精后广泛存在于精液当中，它分为精囊蛋白1(semenogelinⅠ，SEMGⅠ)和精囊蛋白2(semenogelin Ⅱ，SEMGⅡ)，它们是主要的精液凝胶形成蛋白。两者在氨基酸组成上有着78%的相似性，射精后通过二硫键和非共价键参与凝胶结构形成[1-3]。SEMGⅠ是一种具有锌离子结合能力的的蛋白，由一个1.8 kb 大小mRNA 编码。其主要存在于精囊中，同时在附睾、前列腺和睾丸也有少量分泌[4]。结构上，精囊蛋白1 由439 氨基酸残基组成，相对分子质量约52 000，它是一个一级结构由6 个重复单元组成的快速进化蛋白[5]。功能上，精囊蛋白1 及其水解片段具有参与精液凝胶形成、发挥抗菌活性以及抑制激素分泌和精子活率的功能[6-7];目前，已知SEMG Ⅰ具有抑制精子运动的作用，但对其具体发挥功能片段区域报道不一[8-10]。因而，本文将对精囊蛋白1 片段SEMGⅠ-165 进行原核表达以及功能验证， 评估SEMGⅠ的C 端片端是否具有抑制精子活率作用，为研究该蛋白片段结构提供基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂和材料克隆受体菌DH-5α、表达菌ROSETTAⅡ、质粒pET100-△SEMGⅠ、载体pMALc2x-tev 由本实验室保存;PCR 引物从上海生工购买;Ex Taq 酶、dNTP Mixture、10 ×PCR buffer、T4 DNALigase 试剂及限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ 均购自TaKaRa 公司;TEV 酶由本室提供;质粒抽提与凝胶回收试剂盒由美国Omega 公司提供;SemenogelinⅠ(H-300)多克隆抗体从Santa cruz 公司购买;其他化学试剂均为分析纯以上产品。
1.2 构建具有△SEMGⅠ目的基因片段的表达载体通过PCR 从质粒pet100-△SEMGⅠ获得SEMGⅠ目的基因第165～281 位氨基酸序列(△SEMGⅠ)基因片段，其上游引物为5′-AAT GAA TTC AGG CTGTGG GTT CAT GGA CTA AG-3′(下划线指示EcoRⅠ酶切位点)，下游引物为5′-AAT AAG CTTTTA TCGGCC ATG CTG TTG ATC-3′(下划线指示Hind Ⅲ酶切位点);PCR 扩增条件为：95 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性30 s，63 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s，扩增35 个循环，72 ℃延伸10 min。完成后取50 μl 进行琼脂糖电泳并胶回收， 具体步骤参见胶回收试剂盒说明书。对回收后△SEMGⅠ DNA 片段与质粒pMAL-c2x-tev 使用限制性内切酶Hind Ⅲ、EcoRⅠ酶切，完成后建立20 μl T4 DNA 连接酶体系，4 ℃过夜，完成构建。
1.3 重组△SEMG1 蛋白的诱导表达与纯化△SEMGⅠ的重组质粒pMAL-c2x-tev-△SEMGⅠ转化ROSETTAⅡ并扩大培养，接种到终质量浓度1 mg/L 氨苄青霉素、0.34 mg/L 氯霉素表达培养基中，37 ℃扩大培养至OD600 nm约为0.4～0.6，加入IPTG 至终浓度0.3 mmol/L继续培养4 h。6 000 r/min 条件下4 ℃低温离心5 min回收菌体，去除上清。使用buffer 1(pH8.0 Tris-HCl25 mmol/L、150 mmol/L NaCl)重悬菌体，通过Amylose层析柱、Ni 柱纯化、分子筛(HiLoad 16/60 superdex75 prep grade)获得纯化后目的蛋白。
1.4 Western blot 验证与蛋白质谱分析将纯化后的蛋白△SEMGⅠ用5×SDS 蛋白上样缓冲液混合，100 ℃水浴5 min 后进行SDS-PAGE 电泳，将目的蛋白片段转移到PVDF 膜上。使用5%的封闭蛋白干粉封闭液4 ℃封闭过夜，TBST 清洗3 次，每次5 min;之后加入1∶300 比例稀释的抗SEMGⅠ多克隆抗体(H-300，一抗)，室温下孵育2 h，再次TBST 清洗3 次，每次5 min; 再次加入1∶2 500 的稀释的HRP 山羊抗兔IgG(二抗)室温下孵育1.5 h，TBST 清洗3 次，每次5 min;最后加入适量显色液曝光处理。另选取25 μl纯化后目的蛋白△SEMGⅠ进行SDS-PAGE 电泳，切取相对分子质量15 000 大小附近条带， 送第三军医大学中心实验室行MALDI-TOF 蛋白质谱分析。1.5 抑制精子活率试验与统计学分析随机选取16份正常男性精液，经西南医院生殖中心实验室采用梯度离心法和上游法处理，处理后精子终浓度约为(3～7)×106/ml，PR 级精子约98%～99%;纯化后目的蛋白溶解于pH7.0 磷酸盐缓冲液中，采用BCA 法(Beyotime)确定质量浓度为0.5 μg/μl，与处理后精子混合成4个50 μl 蛋白质量浓度梯度体系，在蛋白质量浓度分别为0、0.10、0.15 和0.30 μg/μl 条件下37 ℃孵育70 min，观察孵育后各组精子活率变化[9]。不同质量浓度下每组活率孵育后精子活率值使用均数±标准差表示，孵育后各组活率变化的统计学分析使用单因素方差分析处理， 所有数据均用SPSS 软件(version13.0)处理。
2 结果
2.1 △SEMGⅠ蛋白编码基因克隆与表达载体构建通过PCR 克隆所得△SEMGⅠ基因大小约351 bp(图1a);随后，将目的蛋白基因与载体质粒酶切(图1b)，并完成连接。最终，测序验证质粒重组成功。
2.2 重组后蛋白的诱导与纯化重组后的质粒pMAL-c2x-tev-△SEMGⅠ转化ROSETTAⅡ感受态细胞，IPTG 诱导重组蛋白表达。此时重组蛋白带有麦芽糖结合蛋白标签(maltose-binding protein，MBP)，经过Amylose 层析柱纯化，如图2 中泳道1 位置Mr 57 000存在目的条带(△SEMGⅠ蛋白相对分子质量约为14000;MBP 蛋白相对分子质量约43 000); 再将Amylose 层析柱纯化后蛋白行TEV 过夜酶切(切除蛋白中MBP部分)，再经Ni 柱纯化，得到泳道2 电泳图形，约Mr 14 000 附近出现目的蛋白条带(图2 泳道2);最后Ni 柱纯化后蛋白经分子筛(HiLoad 16/60 superdex 75 prep grade)纯化，选择65 min 出峰时间蛋白电泳，获得纯度大于90%的目的蛋白(图2 泳道3)。
2.3 重组蛋白的Western blot 和质谱分析纯化的重组蛋白片段△SEMGⅠ进行SDS-PAGE 电泳、转膜，随后进行一抗、二抗孵育，最后显色曝光，Mr 14 000处出现一条明显蛋白印记条带(图3)。同时，如图4中更直观表示△SEMGⅠ在全蛋白质位置， 其中239位半胱氨酸为抑制精子活性的关键氨基酸，既往文献认为氨基酸序列24~163 位片段为N 端序列，因此暂称△SEMGⅠ 为C 端序列[9-10]。重新选取重组蛋白△SEMGⅠ约25 μl 进行MALDI-TOF 蛋白质谱分析，验证蛋白氨基酸序列无误(表1)。2.4 抑制精子活率试验与统计学分析通过观察在4种不同质量浓度条件下重组蛋白对孵育后精子活率变化的结果(表2)，我们得出以下结论：△SEMGⅠ在0.10、0.15 和0.30 μg/μl 时对精子的运动具有显著抑制效应，该结论具有统计学意义。
3 讨论
人体内，精囊蛋白与精液的正常液化和精子获能密切相关。整个过程需要精子表面的附睾蛋白酶抑制剂EPPIN 与SEMGⅠ的结合， 在前列腺特异性抗原PSA 和锌离子介导的水解作用下进行[2, 8]。2003年，Miyano 等指出，精囊蛋白与去膜的精子作用时没有精浆移动性抑制的功能， 仅对有细胞膜的精子发挥作用[11];2005 年，王增军等进一步指出人类精子表面EPPIN 蛋白与SEMGⅠ结合位点位于含有239位半胱氨酸的第163-283 位氨基酸序列[12];因此结合本研究结果可以认为精囊蛋白1 片段的C 端165-281序列与EPPIN 结合发挥了抑制精子运动的作用。回顾文献，2007 年王增军等指出精囊蛋白1 中具有抑制精子运动活性的片段位于蛋白N 端部分(氨基酸序列24-163 位)，C 端没有活性[9]，我们认为该结论可能与重组精囊蛋白及其片段使用变复性获得， 蛋白未能正确折叠有关。随后，2010 年Mitra 等指出重组精囊蛋白1 中的239 位半胱氨酸对与附睾蛋白酶抑制剂(EPPIN)的结合和对抑制精子活率有关键作用[10]，该观点支持我们的结论。而关于精囊蛋白抑制精子活率的机制人们认为：精囊蛋白及其水解产物单独或同时通过阻碍超氧化物阴离子产生发挥抑制作用[13];2008 年，Yoshida 等认为精囊蛋白通过与精子表面直接结合发挥抑制作用，同时锌离子参与了介导[14];2009 年，他进一步指出该抑制功能是通过改变精子表面膜结构间接产生[15]。研究中对重组蛋白片段△SEMGⅠ的原核表达，发现表达与纯化过程中存在目的蛋白多聚和降解的现象。例如目的蛋白经过Amylose 层析柱、Ni 柱纯化、分子筛纯化后目的蛋白对比48～72 h 前后蛋白电泳，发现存在降解与多聚现象。而2007 年Malm 等研究发现锌离子主要功能是参与精液凝胶的形成[5];射精后，游离的锌离子对精囊蛋白表达有较强的结合力[16]，因此，考虑在工程菌破碎前与蛋白纯化过程中加入EDTA 溶液与PMSF 溶液螯合金属离子与蛋白酶作用，使得蛋白降解的现象得到明显改善，可以尝试进行目的蛋白结晶研究。未来计划通过进一步优化目的蛋白表达， 为探索精囊蛋白空间结构与研发新型男性避孕疫苗提供基础。