微小RNA(microRNA，miR)-221 和222 是成簇分布的，其基因序列定位于Xp11.3 区，两者相邻呈前后排列。许多研究发现，miR-221 / 222 在肿瘤的发生、发展中起致癌基因或抑癌基因的作用[1]。miR-221 / 222 在包括口腔鳞状细胞癌(oral squamous cellcarcinoma ，OSCC)在内的多种肿瘤中存在表达异常，有望成为相关肿瘤的诊断、预后和治疗的新靶点[2-10]。

　　Zhang 等[11]研究发现，miR-221 / 222 可直接结合第10 号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物基因(phosphatase and tension homolog deleted onchromosome 10，PTEN)3′UTR，其可通过调控PTEN表达而作用于胃癌细胞生长、侵袭和放射敏感性等。miRNA 海绵体是高效的miRNA 抑制剂，其主要机制是通过建立多拷贝特异反义序列，吸附相应miRNA 从而抑制其表达[12]。本研究拟构建miR-221 /222 海绵体载体，同时抑制miR-221 和miR-222 的表达，初步探讨其在OSCC 细胞中的作用。

　　材料与方法

　　一、主要试剂与仪器

　　pDC316-mCMV-EGFP 质粒载体(广州莱德尔)，OSCC 细胞系UM1 细胞和感受态细胞DH5α 由本实验室保存，DNA 凝胶回收试剂盒(Dongsheng Biotech，中国)，T4 DNA Ligase 酶(TaKaRa，日本)，miRNeasyMini Kit 试剂盒(Qiagen，德国)，Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen ， 美国)，SYBR Green qPCRSuperMix(Invitrogen，美国)，BCA 蛋白浓度测定试剂盒(碧云天生物技术研究所，中国)，DMEM/ F12 培养基、Opti-MEM 培养基及胎牛血清(fetal bovine serum，FBS;GIBCO，美国);普通PCR 仪(Eppendorf，德国)，SDS-PAGE 蛋白电泳仪、SDS-PAGE 蛋白转膜仪(Bio-Rad，美国)，Alpha 凝胶成像系统(ZEISS，德国)，RealtimePCR 仪(Roche，德国)，光学显微镜(OLYMPUS，日本)，荧光倒置显微镜(ZEISS，德国)。

　　二、miR-221 / 222 海绵体序列设计及合成

　　根据miRBase 数据库中has-miR-221 的成熟序列(3′-AGCUACAUUGUCUGCUGGGUUUC-5′ ， 序列号MI0000298)和has-miR-222 的成熟序列(3′-AGCUACAUCUGGCUACUGGGU-5′，序列号MI0000299)，设计与has-miR-221 和has-miR-222 成熟序列完全互补的反义序列。将3 个has-miR-221 反义序列和3 个has-miR-222 反义序列以串联的方式连接，每个反义序列间插入-atgcatcg-碱基间隔连接，同时引入酶切位点NotⅠ和HindⅡ，最终合成miR-221 / 222海绵体序列(图1)。将海绵体序列原液稀释20 倍后用于扩增，引物正义链：5′-ataagaatgcggccgcAGATCTGCTAGCCCATATAAGGC-3′，引物反义链：5′-cccaagcttAGCTACATCTGGCTACTGGGTCG-3′。PCR 总反应体系为25 μl，包括0.5 μl 稀释后模板，0.3 μl引物正反义链，2 mmol / L dNTP 混合物2.5 μl，10 ×扩增缓冲液2.5 μl，25 mmol / L MgSO4 1.5 μl，KODPlus Neo 0.3 μl，ddH2O 17.1 μl。循环参数：94℃ 3 min;98℃ 15 s，58℃ 15 s，68℃ 20 s，30 个循环;68℃ 5 min;16℃保存。PCR 产物用DNA 凝胶回收试剂盒回收，得到251 bp 目的基因用于连接反应。

　　三、miR-221 / 222 海绵体载体构建

　　pDC316-mCMV-EGFP 载体经NotⅠ和HindⅡ双酶切后与合成的miR-221 / 222 海绵体序列用T4连接酶于16℃连接2 h，连接产物转入DH5α 感受态细胞后于含氨苄青霉素(Amp，100 μg / ml)的LB平板上铺板筛选，筛选结果送金唯智基因公司测序，序列经鉴定正确后进行后续实验。

　　四、细胞培养和细胞转染

　　UM1 细胞养于含有10% FBS 和1%双抗的DMEM/ F12 培养基中常规培养。转染前1 天对UM1细胞进行传代，使其汇合度为40% ～ 60%，转染采用Lipofectamine 2000 转染试剂。实验分为UM1 细胞组、pDC316 质粒组和miR-221 / 222 海绵体载体组。使用24 孔板，每孔加入500 μl 混合液，UM1 细胞组加入100 μl Opti-MEM 培养基作为A 液，质粒组和海绵体组分别将1 μg pDC316-mCMV-EGFP 质粒和1 μg miR-221 / 222 海绵体载体稀释到100 μlOpti-MEM 培养基中作为A 液;取1 μl Lipofectamine2000 溶解于400 μl Opti-MEM 培养基，作为B 液。B 液混合5 min 后，A 液和B 液混合，静止20 min后加到细胞培养板中，将细胞放回培养箱中常规培养，4 h 后换液。

　　五、实时荧光定量聚合酶链反应

　　转染后24 h 严格按照miRNeasy Mini Kit 试剂盒说明书提取UM1 细胞组、pDC316 质粒组和miR-221 / 222 海绵体载体组细胞miRNA。采用茎环法对提取的miRNA 进行逆转录。以U6 作为内参片段，目的片段has-miR-221 和has-miR-222，上游引物分别为：hsa-miR-221 为5′-ACACTCCAGCTGGGAGCTACATTGTCTGCTGG-3′ ，hsa-miR-222 为5′ -ACACTCCAGCTGGGAGCTACATCTGGCTACTG-3′，下游通用引物hsa-miR-221 / 222 为5′-CTCAACTGGTGTCGTGGA-3′。反应体系共20 μl 包括：稀释20 倍的cDNA模板5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，2× SYBRGreen qPCR SuperMix 10 μl，dH2O 4 μl。循环参数：50℃ 2 min;95℃ 2 min;95℃ 15 s，60℃ 32 s 读板，40 个循环。反应结束后，进行融解曲线分析，温度为65 ～ 95℃。每个样本重复3 次。采用2-DDCt 分析方法计算miR-221 / 222 的相对表达量。

　　六、Western blot 检测

　　细胞转染后48 h 提取各组细胞总蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，10% SDS-PAGE 后转移到PVDF 膜，5%脱脂奶粉封闭1 h 后加一抗， 4℃孵育过夜，TBST 洗膜后相应二抗孵育1 h，洗膜，ECL 试剂盒显影，拍照。

　　七、Transwell 细胞侵袭实验

　　4℃溶解Matrigel 胶过夜，无血清培养基以1 ∶ 4的体积比稀释，取50 μl 加入预冷的Transwell 小室中，37℃孵育2 h 使Matrigel 凝固。细胞转染第2 天，计数8 × 104 个细胞，用100 μl 无血清培养基重悬，加入Transwell 小室上室，在下室加入600 μl 完全培养基。37℃，5% CO2孵育24 h 后，取出小室，用棉签擦去上室的Matrigel 和细胞，4%多聚甲醛溶液固定20 min，磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤，结晶紫染色10 min，PBS 洗涤后显微镜下观察拍照。

　　八、统计学处理方法

　　应用SPSS 13.0 软件对数据进行处理和统计分析，UM1 细胞组、pDC316 质粒组和miR-221 / 222海绵体载体组3 组细胞中miR-221 和miR-222 相对表达量，3 组间两两采用两独立样本t 检验，P <0.05 认为差异具有统计学意义。

　　结果

　　一、miR-221 / 222 海绵体载体的构建及验证

　　miR-221 / 222 海绵体序列与经NotⅠ和HindⅡ双酶切后的pDC316-mCMV-EGFP 载体连接，连接产物转入DH5α 感受态细胞后铺板筛选，阳性克隆结果经测序，反馈序列与设计序列完全一致，见图2。

　　二、细胞转染效率

　　通过脂质体转染试剂Lipofectamine 2000 将带荧光标记的miR-221 / 222 海绵体载体转入UM1 细胞，24 h 后于荧光倒置显微镜下观察带荧光细胞占总细胞的比例，检测转染效率。UM1 各组细胞转染效率均在70%以上，细胞状态良好，满足后续实验要求，见图3。

　　三、转染后miR-221 / 222 的表达

　　实时荧光定量PCR 结果表明，UM1 细胞组、pDC316 质粒组和miR-221 / 222 海绵体载体组中miR-221 相对表达量分别为(0.90 ± 0.15)、(1.00 ±0.08)和(0.17 ± 0.02)，见图4A;miR-222 的相对表达量分别为(0.93 ± 0.04)、(1.00 ± 0.08)和(0.14 ±0.01)，见图4B。3 组中miR-221 的表达：miR-221/222 海绵体载体组与pDC316 质粒组和UM1 细胞组比较，差异均有统计学意义(t1 = 111.69，P1 = 0.001;t2 = 6.98，P2 = 0.002);3 组中miR-222 的表达：miR-221/222 海绵体载体组与pDC316 质粒组和UM1细胞组比较，差异均有统计学意义(t3 = 236.55，P3 =0.001;t4 = 22.06，P4 = 0.001);UM1 细胞组与pDC316质粒组比较，miR-221 和miR-222 表达差异无统计学意义(t5 = -0.86，P5 = 0.44;t6 = -4.86，P6 = 0.08)。

　　四、Western blot 检测转染后蛋白表达

　　Western blot 结果显示，miR-221 / 222 海绵体载体组与pDC316 质粒组和UM1 细胞组比较，PTEN蛋白水平表达显著增强;UM1 细胞组和pDC316 质粒组p-Akt 表达差异不明显，海绵体载体组p-Akt 表达明显减少;3 组细胞总Akt 表达水平差异不明显，见图5。

　　五、Transwell 细胞侵袭实验检测细胞侵袭能力

　　Transwell 实验结果显示，miR-221 / 222 海绵体载体组细胞侵袭能力较对照组降低，pDC316 质粒组和UM1 细胞组无明显差异，见图6。

　　讨论

　　目前，人类基因组确定的成熟miRNA 已超过2500 种，预计调节60%以上人类编码蛋白基因，其中超过50%的miRNA 定位于肿瘤相关区域[13-15]。OSCC 是最常见的头颈部恶性肿瘤，约占口腔肿瘤中的95%，虽然手术结合放化疗的综合治疗方法不断改进，但患者预后仍较差，5 年生存率仅在50%左右[16-18]。随着miRNA 在发育、生理和病理过程中的调节作用的发现与证明，miRNA 相关的基因治疗成为OSCC 治疗研究的热点。Gombos 等[19]研究发现，miR-21、miR-155 和miR-221 在OSCC 中表达异常，与OSCC 的发生密切相关。Yang 等[20]研究发现，增加OSCC 细胞中miR-221 / 222 的表达可以促进癌细胞的生长。江方方等[9-10]研究结果显示，反义miR-222 可靶向上调PUMA 基因表达促进OSCC凋亡。许多研究认为，miR-221 / 222 与OSCC 的发生、发展关系密切，有望成为OSCC 基因治疗的新靶点，但其具体作用机制尚未明确。

　　研究miRNA 作用机制的最好实验方法是使目标靶基因失功能，目前对miRNA 失功能研究中常用的方法有三种：基因敲除技术、反义寡核苷酸抑制技术[21]和海绵体技术[12，22]。基因敲除技术可用于miRNA 的失功能研究，但miRNA 常具有多个编码基因，需要花费大量时间和费用建立基因敲除模型，且有一定技术难度。反义寡核苷酸抑制技术一般用于单个特定的miRNA，且抑制时间较短(24 ～72 h)，在对miRNA 功能长期研究中存在明显局限性[23-24]。海绵体技术是Ebert 等[12]在2007 年最先提出并验证的， 设计包含多个目标miRNA 结合位点的海绵体序列，通过与目标miRNA 的特异性结合达到稳定的抑制作用。海绵体序列可以通过质粒、慢病毒、腺病毒等载体转染入细胞，转染时根据细胞表型和实验需要可以选择不同的载体、启动子和报告基因等，利于细胞的筛选观察。同时，海绵体的持续表达可长时间抑制miRNA 的活动，在细胞培养和体内实验中达到长期稳定的沉默靶miRNA的作用，从而更好的研究miRNA 的功能。此外，对于具有相同种子序列的同家族miRNA，海绵体可以同时抑制其活动，从而研究整个家族miRNA 的功能[12，22]。在miRNA 功能研究中，海绵体技术还可以通过串联不同miRNA 抑制序列，同时沉默不同miRNA，从而研究其共同作用，使实验更加灵活简便。本实验中通过串联miR-221 和miR-222 反义序列构建可同时沉默miR-221 和miR-222 的海绵体载体， 转染至OSCC 细胞UM1 中， 实时荧光定量PCR 结果显示miR-221 / 222 海绵体载体可以同时有效抑制miR-221 和miR-222 表达，从而证明海绵体载体构建成功。

　　PTEN 是1997 年发现的第一个具有双磷酸酶活性抑癌基因，其通过磷酸酶作用，降低信号通路关键酶磷酸化水平，从而阻断通路信号，抑制细胞生长、血管生成、侵袭和迁移，诱导细胞的凋亡[25-27]。PI3K / Akt 是细胞内重要的信号通路，Akt 可通过磷酸化下游因子调节细胞功能，过度活化的Akt 可增强细胞侵袭、增殖和抗凋亡能力[28]。PTEN 通过使3，4，5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化为4，5-二磷酸酯酰肌醇(PIP2)，阻断依赖于PIP3 作用的Akt 的活化，从而抑制肿瘤的发生和发展。生物信息学和荧光素酶报告分析表明miR-221 / 222 可直接结合PTEN3’UTR 调节PTEN 表达[11]。本研究通过转染miR-221 / 222 海绵体载体，抑制细胞内miR-221 / 222 表达，Western blot 结果表明，转染miR-221 /222 海绵体载体的UM1 细胞PTEN 表达上调， 而pAkt 蛋白表达水平下调。细胞侵袭实验中海绵体转染组细胞侵袭能力减弱，表明miR-221 / 222 海绵体载体可能通过上调PTEN 表达，抑制PI3K / Akt 信号通路，达到抑癌作用。本研究成功构建miR-221 /222 海绵体载体，并初步验证其对OSCC 细胞侵袭性的抑制作用，为进一步深入研究奠定基础。