口腔鳞状细胞癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)是常见的头颈部恶性肿瘤，目前治疗以手术和放化疗为主，但患者5年生存率无明显提高[1]。OSCC患者存在着较严重的免疫缺陷，因此近年来提高机体免疫系统对抗肿瘤的免疫治疗成为研究热点[2-3]。在肿瘤浸润的白细胞中，髓样来源的抑制细胞(myeloid-derived suppressor cell，MDSC)是免疫抑制作用网络中的重要成员[4]，构成了有着不成熟状态和抑制T细胞增殖作用的髓样细胞的异质群体。本研究建立4-硝基喹啉-1-氧化物(4-nitroquinoline-1-oxide，4NQO)舌癌小鼠模型，观察MDSC在舌癌小鼠中的表达，并探讨其在口腔癌中的意义。
1 材料和方法
1.1 4NQO舌癌模型建立
36只雌性4~6周龄的C57BL/6小鼠及标准固体饲料均由中山大学实验动物中心提供。在无特异病原体条件下饲养，室温18~25 ℃，湿度30%~50%，24 h光暗循环条件下，标准饲料经钴60辐照后喂养。4NQO用双蒸水配制成0.5 g·L-1母液。实验组24只小鼠用避光瓶喂养，4NQO母液用灭菌普通自来水配成50 mg·L-1工作液，每周更换4NQO水，连续饮用16周后，改为饮用普通灭菌自来水至第28周。对照组12只小鼠饮用普通灭菌自来水28周。
1.2 取材及组织病理学观察
在第16、20、24及28周时，6只实验组小鼠及3只对照组小鼠予4%水合氯醛镇静后经眼眶取外周血，处死后取全舌标本。舌标本一半立即冰冻固定用于实时定量聚合酶链反应(quantitative real timepolymerasechain reaction，qRT-PCR)或后续免疫组织化学染色，另一半立即固定于10%中性甲醛缓冲液中，24 h后乙醇梯度脱水，石蜡包埋，4 μm切片，常规苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色。
1.3 免疫组织化学染色
根据组织学结果，实验分为3组：正常对照组12只，异常增生组9只，OSCC组12只。采用葡聚糖聚合物法(labelled dextran polymer method，LDP)，切片经脱蜡、修复抗原、灭活内源性过氧化物酶及室温封闭后，滴加anti-Ki67单抗4 ℃孵育过夜。加入二抗室温孵育，二氨基联苯胺(3,3′-diaminobenzidine，DAB)染色，苏木素复染。阴性对照省略一抗孵育步骤。光学显微镜400倍视野下观察切片并计数，计算阳性细胞百分比，每个样本取10个视野，计算均值，表示为标记指数(labeling indices，LI)。
1.4 流式细胞学分析
根据前述组织学结果分为3组的小鼠，再行流式细胞学分析。每只小鼠血液分为两份样本，分别加入30 μL血，一份用抗CD11b和粒性白细胞分化抗原-1(granulocyte-differentiation antigen-1，Gr-1)抗体，另一份用抗CD3、抗CD4和CD8抗体，进行荧光标记并染色。两份标本分别加入红细胞裂解液100 μL，室温裂解并PBS洗涤后进行流式细胞仪检测。
1.5 小鼠病变组织免疫组织化学染色
优化的切片温度(optimal cutting temperature，OCT)包埋的组织制成4 μm冰冻切片，冰丙酮固定，灭活内源性过氧化物酶，室温封闭后，Gr-1单抗1︰10后的切片4 ℃孵育过夜。加入生物素化二抗室温孵育，再加高灵敏度的链霉亲和素(high sensitivitystreptavidin，HSS)-辣根过氧化物酶室温孵育后DAB染色，苏木素复染。阴性对照省略一抗孵育步骤。光镜下观察切片。
1.6 qRT-PCR
分组同前述。采用Trizol法提取舌病变组织内总RNA，将提取的总RNA逆转录为cDNA用于聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)扩增。实验引物如下。精氨酸酶1(arginase 1，ARG-1)上游引物序列：5′-GAAGAACCCACGGTCTGTGG-3’，下游引物序列：5′-TCCAACTGCCAGACTGTGGTC-3′; 甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphatedehydrogenase，GAPDH)上游引物序列：5′-CGTGTTCCTACCCCCAATGT-3’，下游引物序列：5′-TGTCATCATACTTGGCAGGTTTCT-3’。PCR反应条件：93 ℃ 3 min，93 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，共40个循环。将每个样本mRNA水平与相应GAPDH表达水平之比得到目的基因的标准化表达水平，再与正常小鼠的表达水平相比较，计算出表达倍数。
1.7 统计学分析
采用SPSS 16.0软件进行统计学分析，所得数据用均数±标准差表示。MDSC的数值是占外周血细胞的百分比，CD3+CD4+和CD3+CD8+的数值是占淋巴细胞总数的百分比。组间差异的比较采用ANOVA分析。Spearman相关系数用于评价两个指标间的相关性。P<0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 4NQO诱导小鼠舌组织癌变
在第28周观察期结束时，每只实验组小鼠口腔黏膜都出现一个或以上病变，病变部位多位于舌背黏膜，呈现乳头状或菜花状新生物，伴轻微糜烂现象。随时间延长，实验组小鼠出现了由正常黏膜，经上皮单纯性增生，到异常增生，最终发展成早期浸润癌的组织学变化过程。第16周时6只4NQO诱导(实验组)小鼠有3只(50%)出现异常增生，3只(50%)出现单纯性增生;20周时6只实验组小鼠有4只(67%)出现异常增生，2只(33%)出现浸润癌;24周时6只实验组小鼠有2只(33%)出现异常增生，4只(67%)出现浸润癌;28周时6只(100%)实验组小鼠出现浸润性癌(图1)。同时间点的3只对照组小鼠均未发现异常增生、上皮层次紊乱等变化。根据组织学结果，后续实验分为3组：异常增生组9只，OSCC组12只，正常对照组12只。
2.2 Ki67免疫组织化学染色
正常舌黏膜基底层细胞胞核呈现Ki67阳性染色，LI为20.31%±2.42%;在上皮单纯性增生时，Ki67表达不仅位于基底细胞层，有的甚至累及基底细胞上层，LI为25.08%±2.14%;在上皮异常增生区域，阳性表达进一步增加，LI为31.11%±3.58%;Ki67在OSCC中呈弥散性表达，LI为46.75%±3.46%。单纯增生组、异常增生组和OSCC组LI明显高于正常组(图2)。
2.3 MDSC细胞和T细胞亚群在外周血的变化
在肿瘤进展过程中，从正常对照组到异常增生和OSCC组，外周血MDSC细胞持续显著增加(P<0.01)。OSCC组CD3+CD8+细胞百分比较正常对照组与异常增生组明显升高(P<0.01)，但正常对照组与异常增生组间无明显变化(P=0.062)。当3组比较时，CD4+/CD8+比差异有统计学意义(P<0.01)。配对比较发现各组之间差异均有统计学意义(P<0.05)，然而，CD3+CD4+细胞未发现明显增加(P=0.534)(表1、图3)。
2.4 小鼠外周血中MDSC细胞与T细胞亚群及CD4+/CD8+比相关性分析结果
相关性分析发现，MDSC细胞与CD3+CD8+细胞呈现正相关(r=0.772，P<0.01)，MDSC细胞比例与CD4+/CD8+比呈现负相关(r=-0.830，P<0.01)，但MDSC细胞与CD3+CD4+细胞无明显相关(r=0.181，P>0.05)。
2.5 MDSC细胞在病变组织中的表达
在实验组小鼠的舌黏膜中，表达阳性Gr-1的免疫细胞(MDSC细胞)的细胞膜呈棕黄色(图4)。异常增生区域的MDSC细胞较正常对照组有所增加，在OSCC区域的肿瘤组织内及与正常组织的交界处，均浸润了大量的MDSC细胞。
2.6 口腔病变对酶类基因表达的影响
检测了ARG-1在正常舌黏膜和4NQO诱导的舌黏膜病变部位的表达水平。qRT-PCR结果显示，ARG-1 mRNA在异常增生组织中的表达高于在正常舌黏膜中的表达，而在OSCC中的表达高于正常舌黏膜和异常增生组织中的表达(P<0.05)。其中，OSCC小鼠舌癌部位ARG-1 mRNA表达水平较正常小鼠舌黏膜显著升高(4.80±1.46)倍(P=0.01)。因此，ARG-1 mRNA的表达是随着肿瘤进展而增加。
3 讨论
舌癌的发生发展是一个多步骤复杂的过程。4NQO作用于口腔黏膜上皮，可能是通过引起DNA的损伤和诱发基因突变，诱导了舌癌的发生发展[5-6]。本研究组织病理学发现4NQO作用后，小鼠的舌黏膜出现了由正常黏膜向癌前病变和鳞癌转变的过程。Ki67免疫组织化学染色结果也同样证实了该过程。Ki67是一种与细胞周期相关的核蛋白，作为增殖标志物常用于检测增殖细胞的表达，其表达量与肿瘤的恶性程度相关[7-8]。
髓细胞生成的异常是肿瘤免疫逃逸的重要原因[9]。这群细胞的增长可诱导T淋巴细胞对抗原刺激的无应答[9-10]，因此被命名为MDSC细胞。MDSC细胞在肿瘤状态下可大量积蓄[2,11-12]。笔者发现4NQO诱导的小鼠随病变进展，外周血中Gr-1+CD11b+MDSC比例逐渐增加，明显高于对照组。这说明MDSC的扩增可能是促肿瘤发展环节中的重要一步。
CD4+和CD8+T细胞在介导抗肿瘤免疫应答中有重要作用[13-14]。本研究发现，随肿瘤进展，外周血中CD3+CD8+T细胞比例逐渐升高，CD4+/CD8+比降低，与正常对照组相比，差异有统计学意义。随肿瘤进展，CD4+/CD8+比的减少可能是由于CD3+CD8+T细胞的扩增所致，这也提示了荷瘤小鼠免疫功能逐渐减弱。Gannot等[15]也发现肿瘤负荷可影响系统免疫应答。本研究还发现MDSC比例与CD3+CD8+T细胞比例存在正相关性，与CD4+/CD8+比显示负相关关系。这提示机体可能通过降低CD4+/CD8+比和提高MDSC比例来影响抗肿瘤免疫应答。这些发现提示MDSC的扩增与肿瘤进展及机体免疫力低下有关。
MDSC在小鼠体内的表型定义为Gr-1+CD11b+的细胞群。OSCC的临床行为可能与肿瘤侵袭前沿浸润炎性细胞的类型有关。Yang等[16]对小鼠乳腺癌组织MDSC采用Gr-1抗体标记后发现，在肿瘤与腺体组织的交界处即肿瘤侵袭前沿浸润了大量的MDSC。本研究免疫组织化学也发现，肿瘤组织中散在分布的MDSC在侵袭前沿表达较丰富，而在正常舌和异常增生舌黏膜区域表达较少。异常增生小鼠的外周血中MDSC较正常小鼠显著增高，然而在舌病变部位异常增生区域表达较少，可能由于异常增生区域诱导分泌的细胞因子和趋化因子较少，造成了MDSC在局部微环境中的变化与循环中的变化的差别。ARG-1可能参与MDSC诱导的免疫抑制作用[9, 17]。本研究发现随舌癌进展，ARG-1 mRNA水平逐渐升高。这提示ARG-1基因水平的上调可能参与了口腔癌MDSC的扩增。在肿瘤微环境中，MDSC中ARG-1的过表达，消耗了局部微环境中L-精氨酸的水平，导致T细胞受体信号通路的失调，使CD8+T细胞无应答[18]。这提示MDSC浸润至肿瘤组织，创造了一个有利于肿瘤进展的微环境，并且可能通过ARG-1发挥免疫抑制作用。
综上所述，本研究显示荷瘤小鼠的舌黏膜出现OSCC时，舌和外周血的MDSC水平显著升高，并与病变部位ARG-1的表达呈正相关关系。这提示MDSC的扩增有可能是肿瘤进展的重要原因，ARG-1基因水平的上调可能参与了这一过程。MDSC可能是口腔癌免疫治疗的新靶点。