?

　　大肠杆菌具有遗传背景清晰、载体系统完备、生长周期短、遗传稳定等优点，是目前外源蛋白重组表达最常用宿主系统。然而，因原核系统的限制，外源基因在大肠杆菌中的表达常常存在表达量不高、可溶性低、无法进行正确的翻译后修饰等问题，特别是外源基因在大肠杆菌中高表达时，往往不能正确折叠而是相互聚集形成无活性的包涵体。包涵体必须进一步复性才能得到有活性的目的蛋白，包涵体的体外复性往往费时费力、效率较低，一定程度上限制了大肠杆菌这一宿主系统的广泛应用。

　　为了克服包涵体的形成，目前广泛使用的策略是目的蛋白与分子伴侣等共表达，或与具有助溶活性蛋白或蛋白标签，如小泛素相关修饰蛋白( smallubiquitin-related modifier，SUMO) 、硫氧还蛋白( thioredoxin，Trx) 、谷胱甘肽-S-转移酶( glutathione Stransferase，GST) 、麦芽糖结合蛋白( maltose-bindingprotein，MBP) 等的融合表达，相应载体系统也得到广泛使用。然而，融合表达存在一定的局限，如融合标签蛋白可能会影响目的蛋白的活性和结构;为了得到天然目的蛋白，融合蛋白标签通常需要经酶切或化学试剂去除，相应增加了成本，即使融合蛋白表达水平较高，经过各种分离程序之后，目的蛋白的量也可能非常有限。因此，寻找新的策略实现外源蛋白在大肠杆菌中非融合的可溶表达具有重要意义。

　　除直接融合表达外，也有研究发现，小分子伴侣、抗体和抗原、相互作用蛋白的共表达等，也能提高目的蛋白的可溶性。近年研究发现，SUMO 是一种具有广泛助溶活性的蛋白，具有表达量高、相对分子质量小、助溶活性谱广等特点，使用其构建的融合表达载体成为目前使用最广泛的原核表达载体之一。截至2013 年4 月，已经实现了230 多种蛋白在大肠杆菌中的高效表达。为了利用SUMO 的广谱助溶活性等优点，同时避免融合表达目的蛋白需要切割纯化等缺点，本研究利用翻译偶联现象，构建了一种新型非融合、可溶表达载体pTIG-mSUMO，并利用其实现了广谱抗病毒蛋白RA 或双链RNA 活化胱天蛋白酶寡聚化蛋白( double-stranded RNA activatedcaspase oligomerizer，DRACO)在大肠杆菌中的高效、可溶性表达。

　　1 材料与方法

　　1. 1 材料

　　大肠杆菌DH5α 感受态细胞、DNA 纯化回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒及Anti-His Antibody( 小鼠单克隆抗体lgG2b) ( 北京天根生物技术公司) ; 大肠杆菌Transetta( DE3) 感受态细胞和DNA 标志物( 北京全式金生物技术有限公司) ; 蛋白标志物以及T4 DNA 连接酶( Fermentas 公司) ; 限制性内切酶( NdeⅠ、EcoRⅠ、XhoⅠ、SacⅠ、NotⅠ) [大连宝生物公司( TaKaRa) ]; Es taq MasterMix( + dye) ( 北京壹诺金生物技术有限公司) ; 氯霉素、氨苄青霉素( Amresco公司) ; 辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG( 中杉金桥公司) ; 底物发光试剂( Beyotime 公司) ;质粒pET22b、pET /RA-22b 以及酵母基因组( 本实验室保存) ; 其他试剂均为国产分析纯。

　　1. 2 引物设计

　　依照NCBI 数据库中报道的基因序列，在上下游引物中分别设计合适的酶切位点用于克隆，具体引物序列如表1 所示，引物由苏州金唯智生物技术有限公司合成。

　　1. 3 翻译偶联载体pTIG-mSUMO 的设计与构建

　　根据SUMO 标签蛋白的基因smt3 序列，利用表1 中的相应上下游引物，以酵母基因组为模板，PCR扩增目的片段( 94℃ 预变性4 min; 94℃ 变性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，30 个循环; 72℃保温10 min) 。1%琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，用DNA 纯化回收试剂盒回收PCR 产物。

　　以上轮回收的PCR 产物为模板，对其中EcoRⅠ酶切位点进行突变PCR。分别以smt3( AGA-CGT) F +smt3( EcoRⅠ) R 和smt3 ( NdeⅠ) F + smt3 ( AGACGT)R 为引物进行PCR 扩增，条件同上，进行PCR后纯化回收，获得产物分别命名P1 和P2。再以P1 和P2 共同为模板，以smt3 ( NdeⅠ) F和smt3( EcoRⅠ) R 为上下游引物。同样使用Es taqMasterMix( + dye) 进行PCR 扩增获得去除EcoRⅠ酶切位点的SUMO 突变体smt3 mutant。以NdeⅠ和EcoRⅠ双酶切片段smt3 mutant 后，与经同样限制性内切酶处理的pET-22b 载体连接，构建表达载体pTIG-mSUMO，其多克隆位点序列如图1 所示。

　　此载体在SUMO 的C 端添加了BamHⅠ、AAGGAGG以及EcoRⅠ位点等，具有以下特点: EcoRⅠ位点后的TAATG 既含有上游SUMO 序列的终止密码TAA，同时与下游基因的起始密码ATG 相互重叠; AAGGAGG 作为第2 个核糖体结合位点RBS2，启动下游偶联基因的翻译，从而实现单一顺反子中目的基因的非融合表达; 通过调整RBS2 与下游ATG 间的序列和距离，调节外源蛋白的表达; 保留了pET-22b 多克隆位点中的绝大多数限制性酶切位点，便于外源基因的克隆。

　　1. 4 RA 表达质粒pTIG-mSUMO/RA 的构建

　　根据目的蛋白RA 的基因序列，以表1 中的RA-FE 和RA-RX 为上下游引物，以pET /RA-22b 为模板，PCR 扩增目的片段( 94℃ 预变性4 min; 94℃变性30 s，60℃退火60 s，72℃延伸80 s，30 个循环;72℃延伸10 min) 。1% 琼脂糖凝胶电泳观察后，用DNA 纯化回收试剂盒回收PCR 产物。用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切回收PCR 产物片段和表达载体pTIG-mSUMO，使其分别形成带有黏性末端的双链。1% 琼脂糖凝胶电泳拍照后，用T4DNA 连接酶连接酶切后的载体和片段; 转化大肠杆菌DH5α 感受态细胞，挑取单克隆，振荡培养并提取质粒，进行PCR 鉴定和酶切鉴定后选取结果正确质粒送苏州金唯智生物技术有限公司测序。

　　1. 5 目的蛋白的诱导表达

　　取序列完全正确的RA 表达质粒pTIG-mSUMO/RA 转化大肠杆菌Transetta( DE3) 感受态细胞，37℃温箱倒置培养; 挑取单克隆于含抗生素的液体培养基37℃摇床过夜培养，第2 日以1%转接，培养至对数中期，即D600为0. 4 ～ 0. 8 时加1 mmol /L IPTG 诱导培养3 ～ 5 h。

　　1. 6 目的蛋白表达的检测

　　离心浓缩诱导产物，15% SDS-PAGE 电泳后进行考马斯亮蓝染色和脱色液脱色，检测目的条带。同时进行SDS-PAGE 后，通过电转仪电转至硝酸纤维素膜上; 5%脱脂奶粉室温封闭2 h; 加入用5% 脱脂奶粉以1∶ 1000 稀释的抗His 标签鼠单克隆抗体，4℃过夜孵育约12 h，TBST 洗膜3 次后，辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG 以1∶ 5000 稀释后室温孵育1 h，TBST 洗膜3 次后，加混匀的底物发光A、B液后显影。

　　2 结果

　　2. 1 翻译偶联载体pTIG-mSUMO 的构建与鉴定

　　本研究通过定点突变和PCR 方法获得了优化后的目的基因smt3 mutant，琼脂糖凝胶电泳显示条带与预期相符，为305 bp。进行酶切连接构建完成翻译偶联载体pTIG-mSUMO 后，以T7promoter 和T7 Terminator为引物进行菌落PCR 鉴定，条带与预期相符。将质粒以T7promoter 为引物进行测序，突变位点与预期相符。同时多克隆位点、翻译偶联区域与设计完全一致。

　　2. 2 重组表达质粒pTIG-SUMO/RA 的构建与鉴定

　　以实验室保存的pET/RA-22b 质粒为模板，PCR扩增RA( 1353 bp) 表达序列，获得1375 bp DNA 片段，与预期一致。将PCR 产物和载体分别用EcoRⅠ和XhoⅠ双酶切后连接，转化，挑取单克隆进行菌液PCR 鉴定，获得条带与预期一致。将所得阳性克隆提取质粒进行酶切鉴定，与预期相符，分别约为( 1680 + 5360) bp 和( 1370 + 5670) bp。DNA测序结果表明，质粒构建完全正确。

　　2. 3 诱导表达目的蛋白RA 的检测

　　IPTG 诱导表达后，制备蛋白样品进行SDSPAGE电泳检测，以目的蛋白单独表达为对照，非融合表达的目的条带清晰，相对分子质量与预测大小相符，约50 × 103，表达量较pET-22b 载体中单独表达有明显增加。同时，SDS-PAGE 电泳后进行Western印迹检测，使用的抗His 鼠单克隆抗体能够特异性地识别6 个组氨酸标签蛋白，可见目的蛋白表达量相对于单独表达量有所增高。使用Gel Pro 软件半定量分析可知，RA 约为单独表达的2 倍，且可溶蛋白约占总目的蛋白表达量的50%。

　　3 讨论

　　双顺反子表达质粒能够有效促进外源基因在大肠杆菌中的高效表达，并且可通过调节SD 序列的组成以及与起始密码子ATG 的距离调节目的基因的表达。

　　我们在早期研究中发现，利用原核系统的翻译偶联现象，构建了独特的非融合、可溶性高效表达载体系统pTIG-Trx，实现了细菌毒素、细胞因子、单链抗体、聚酮合酶( polyketide synthase，PKS) 等70 多种蛋白及其突变体在大肠杆菌中的高效、可溶性表达，相关文章发表于Mol Immunol、Mol Biotechnol 以及生物工程学报等众多国内外期刊，在协和医学院、北京大学等众多单位得到了广泛使用。本研究利用翻译偶联机制，克服了融合表达载体的缺点，成功构建了一种新型高效可溶的非融合原核表达载体pTIG-mSUMO，实现了广谱抗病毒蛋白RA 在大肠杆菌中的高效、非融合可溶性表达。

　　此原核表达载体是在pET-22b 载体中的多克隆位点进行改造，含有原核翻译增强序列及调控元件，可有效实现对目的基因的表达和调节。每个基因表达框含有独立的核糖体结合位点和终止子，基因表达相对独立，可一定程度实现部分目的蛋白的高效、非融合的可溶表达，极大减少了蛋白纯化和复性步骤及成本。另外，此载体还具有以下特点: ①含有常见酶切位点NdeⅠ、BamHⅠ、HindⅢ、EcoRⅠ、XhoⅠ等，可方便目的基因的插入; ②可通过调节SD 序列的组成、数目及与起始密码子ATG 的距离，有效调节目的基因的表达; ③此RA 表达质粒的目的蛋白插于载体的EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点间，在产物连接后利用原载体中EcoRⅠ/XhoⅠ酶切位点间多克隆位点( 如NotⅠ、SacⅠ等) 进行酶切，极大提高了阳性克隆率，减小了RA 表达质粒的鉴定范围; ④His标签对蛋白本身特性几乎不会造成影响，本载体利用pET-22b 载体中自带的6 × His 标签，可方便进行Western 印迹检测和目的蛋白的纯化分离。本载体的构建克服了融合表达需要切除标签蛋白的缺点，可在一定程度上相对独立地提高目的蛋白的表达量和可溶性，也很可能存在一定的普遍适用性，对蛋白药物的大规模生产具有重要意义。