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　　生长分化因子15 ( growth differentiation factor15，GDF15) ，属于转化生长因子- β( transforminggrowth factor – beta，TGF – β) 超家族成员之一。GDF15 作为一种应激反应蛋白，在多种器官损伤、缺氧、压力、肿瘤等病理情况下，被诱导表达。近年来研究发现，GDF15 与心血管疾病相关。在冠心病、缺血再灌注损伤、心肌肥厚及心力衰竭等病理过程中，GDF15 在心肌细胞中大量表达。有文献报道，GDF15 经p53 /HIF – 1α 信号通路促进血管形成，而在病理情况下，GDF15 是否可以通过促进血管生成，改善局部微循环这条途径保护心脏，目前尚不明确。同时GDF15 的这种功能能否用于组织工程和再生医学也有待进一步研究。本实验首先合成GDF15 基因，进而构建GDF15 基因过表达慢病毒载体，有助于对GDF15 在心血管方面的生理功能、作用机制以及组织修复中的应用进行深入探索。

　　1 材料与方法

　　1. 1 主要材料与仪器

　　pCDH – CMV – MCS – EF1 – copGFP ( SBI，日本) ; Taq 酶、dNTP、DH5α 感受态细胞、琼脂糖凝胶DNA 回收试剂盒、DL2000 DNA Marker ( Takara，日本) ; In – FusionTM PCR Cloning Kit ( clontech，日本) ; EcoR I、BamH I( NEB，美国) ; 小抽试剂盒( Promega，美国) ; 1 kb DNA ladder Marker ( Fermentas，美国) ;引物合成( 上海捷瑞生物工程有限公司) ; 阳性克隆测序( 华大基因) ; DNA 电泳槽，稳压电泳仪( 北京六一仪器厂) ; 电热恒温水槽( 上海一恒科学仪器有限公司) ; 凝胶成像仪( 上海天能科技有限公司) ; 恒温培养箱( 上海精宏实验设备有限公司) ; 恒温摇床( 太仓市实验设备厂) ; PCR 仪( Applied Biosystems，美国) ; 冷冻高速离心机( Thermo，美国) ; 移液器( Eppendorf，德国) 。

　　1. 2 实验方法

　　1. 2. 1 PCR 扩增GDF15 基因

　　根据Genbank 文库中收录的GDF15 基因序列( NM_004864. 2) ，设计基因引物。上游引物序列( GDF15 – EcoR I – F) : TAGAGCTAGCGAATTCGCCACCATGCCCGGGCAAGAACTC(下划线处为EcoRI 酶切位点) ; 下游引物序列( GDF15 – BamH I – R) :TCGCGGCCGCGGATCCTCATATGCAGTGGCAGTCTTT(下划线处为BamH I 酶切位点) 。以GDF15 基因为模板，PCR 扩增目的基因片段。PCR 条件: 98℃预变性3 min; 98 ℃变性10 s， 55 ℃复性15 s， 72℃延伸1 min，循环30 次; 72 ℃ 延伸10 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，用DNA 标志物判断扩增基因片段的大小。

　　1. 2. 2 目的基因同源重组入表达载体

　　用EcoR I 和BamH I 对目的基因片段的PCR产物及pCDH – CMV – MCS – EF1 – copGFP 表达载体进行双酶切，回收酶切产物。设计分组: GAPDH组、自连对照组、GDF15 组。同源重组反应体系: 胶回收后的目的基因片段( 每组各5 μL，40 ng /μL) ，线性化的表达载体( 每组各5 μL，40 ng /μL) ， 10 ×缓冲液( 每组各2 μL) ， 10 × 牛血清白蛋白( 每组各2 μL， 500 μg /mL) ， In – Fusion 酶( 0. 5、0、0. 5 μL) ，ddH2O( 每组各20 μL) ，反应条件: 37 ℃ 15 min; 50℃ 15 min。

　　1. 2. 3 转化感受态细胞及阳性克隆鉴定

　　连接产物转化100 μL DH5α 感受态细胞，冰浴30 min，42 ℃热激90 s，然后冰浴2 ～ 3 min，加入900μL Luria – Bertani( LB) 培养液，37 ℃摇菌1 h。取适当量的转化菌涂布于LB 琼脂平板上。倒置平皿，37 ℃培养16 h。挑取平板上长出的转化子溶于10 μL LB 培养液中，从中取1 μL 为模板，以引物( CMV – F: CGCAAATGGGCGGTAGGCGTG; EF1 -R: CGCCACCTTCTCTAGGCAC) ，进行菌落PCR 鉴定。PCR 循环参数: 94 ℃预变性5 min; 94 ℃变性30 s， 55 ℃复性30 s， 72 ℃延伸1. 5 min，循环30 次;72 ℃延伸10 min。PCR 产物用琼脂糖凝胶电泳初步分析，用DNA 标志物判断扩增片段的大小，选取阳性克隆送测序。

　　1. 2. 4 慢病毒包装

　　将构建的慢病毒载体与包装质粒按一定比例进行混合，转染到293T 细胞中。慢病毒的包装由上海生博医学生物工程科技有限公司完成。收集转染的293T 细胞上清液，离心，弃上清，使用无菌的PBS 溶解，过滤，冻存于- 80 ℃备用。

　　1. 2. 5 慢病毒滴度测定

　　将293T 细胞按1 × 105 个/孔接种24 孔板，分别加入10、5、1 μL 病毒液， 72 h 后拍照记录荧光，估计慢病毒转染目的细胞的效率。收取细胞抽取基因组DNA 并做定量PCR 实验测定滴度( IU/mL) 。计算公式如下: 滴度= ( C × n × D × 1 000) /V。C = 平均每基因组整合的病毒拷贝数，n = 转染时细胞的数目( 约为1 × 105 ) ，D = 病毒载体的稀释倍数，V =加入的稀释病毒的体积数。

　　1. 2. 6 Western blot 鉴定GDF15 的表达

　　取293T 细胞，设置空白对照组和GDF15 组。空白对照组为原始293T 细胞，GDF15 组用慢病毒转染293T 细胞。使用细胞裂解液裂解细胞，测蛋白浓度后，将每个样品蛋白终浓度调整为2 g /L，- 80℃保存备用。制备SDS – PAGE 胶，上样，电泳: 30mA 2 h。电泳结束后，将蛋白转移到PVDF 膜上。用含5%脱脂牛奶的TBST 溶液室温封闭PVDF 膜1h; 封一抗，4℃过夜，TBST 洗膜3 次，每次10 min;封二抗，室温2 h，TBST 洗膜3 次，每次10 min; 采用Amersham 公司ECL + plusTM Western blotting system试剂盒进行显色，X 光显影。

　　2 结果

　　2. 1 PCR 扩增目的基因片段

　　PCR 成功扩增出GDF15 序列的目的基因片段，PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱可见大小约为965bp 的特异性条带。

　　2. 2 菌落PCR 鉴定

　　菌落PCR 对转化子的重组质粒进行鉴定，得到1 176 bp 的片段，即阳性克隆。

　　2. 3 阳性克隆测序结果

　　阳性克隆测序结果显示，所测序列和目标序列完全一致。

　　2. 4 慢病毒滴度的测定

　　慢病毒转染293T 细胞后，对比荧光显微镜下同一视野的荧光和可见光照片。经检测，慢病毒滴度为4 × 108 IU/mL。

　　2. 5 Western blot 检测GDF15 过表达

　　将293T 细胞提取总蛋白，以GADPH 作为内参，Western blot 检测GDF15( 相对分子量25000) 的表达，结果显示GDF15 组相对于原始293T 细胞，GDF15 蛋白的表达量明显增加。

　　3 讨论

　　GDF15 首次是从U937 细胞的cDNA 文库中分离出来，属于TGF – β 超家族成员之一，其基因定位于染色体19p12 – 13. 1，包括2 个外显子和1 个内含子。GDF15 是一个分泌型蛋白，其前体蛋白经酶切后通过二硫键连接成具有生物活性的同源二聚体。目前，已知的GDF15 主要的生物学功能包括: 抗炎症反应、抗细胞凋亡、抑制肿瘤细胞生长等。近年来，越来越多的证据表明，GDF15 与心血管病的发生相关。有研究发现，冠心病，心肌梗塞，缺血性脑卒中患者的血清中可以检测到GDF15水平的升高。Kempf 等发现在心肌缺血模型小鼠发生心肌梗塞后，其周围组织和血清中GDF15表达水平明显升高，而GDF15 敲除的小鼠发生心肌梗塞后，梗死的面积较野生型的小鼠更为广泛。如果给予GDF15，则可以有效缩小其梗死面积。研究表明，在心血管疾病的的发生发展过程中，GDF15水平的升高可以起到保护作用。有研究显示，GDF15 具有促进血管形成的功能。而GDF15 的这种保护作用与成血管，改善微循环的相关性仍待进一步研究。

　　同时，GDF15 的成血管功能为组织工程中颌骨缺损修复提供了新思路。研究表明组织液的扩散仅能满足组织工程细胞材料复合体表面100 ～ 200 μm内细胞的营养供给，而其内部大量的细胞常常得不到营养而死亡。如何为植入的种子细胞及时提供所需营养，改善中心区细胞所处的缺氧状态，成为大块骨缺损修复研究的方向之一。组织工程骨的血管化技术由于促进了早期新生血管的长入，有效地缩短了骨缺损修复的时间，加快了骨缺损修复的速度，提高了大块组织工程骨的质和量，已经成为了当前研究的核心。构建血管化组织工程颌骨常用方法主要包括将细胞材料复合体植入大动脉附近或植入血管束，从而形成带血管蒂的组织工程颌骨; 或加入血管内皮细胞或促血管生成的生长因子，促进组织工程颌骨的血管化等。前者手术范围的扩大，增加了病人的痛苦，加重了患者的负担，而后者临床效果仍需要进一步研究评价。目前，探索基因修饰的血管化组织工程骨用于大块颌骨缺损的修复依然是研究的热点和难点。因此，研究GDF15 的成血管功能对于颌骨缺损修复具有重要的意义。

　　慢病毒载体是指以人类免疫缺陷病毒- 1( HIV – 1) 来源的一种病毒载体，能高效地将目的基因导入细胞。慢病毒载体有转染效率高、携带基因片段容量较大、目的基因在宿主细胞中可以长时间稳定表达等优点，是转移目的基因的理想载体。

　　本研究以慢病毒载体pCDH – CMV – MCS -EF1 – copGFP 为基础，首先用PCR 扩增目的基因GDF15，经琼脂糖凝胶电泳鉴定。然后将目的基因同源重组入表达载体，构建带有GDF15 基因的重组慢病毒质粒，菌落PCR 鉴定后，选取阳性克隆送测序，测序结果与目标序列完全一致。之后通过包装得到慢病毒，用慢病毒体外转染293T 细胞。最后Western blot 实验在蛋白质水平检测到GDF15 表达明显增加，说明慢病毒转染成功。因此，本实验成功构建了GDF15 基因过表达慢病毒载体，为后期进一步研究GDF15 的功能、机制以及在颌骨缺损修复方面的应用奠定基础。