中药现代化研究的核心问题之一是中药有效成分和有毒成分的确定。传统中药绝大多数以方剂的形式通过口服吸收而发挥作用，而中药的某些成分在肠内与细菌发生相互作用后被吸收入血才能成为药效物质，因此，从肠内菌生物转化的角度来研究中药的有效成分和有毒成分具有十分重要的意义。
近几年，中药在肠内的代谢也引起了广泛的重视，已有大量研究证实了肠内菌对于中药在体内的吸收，以及药效物质或毒性物质的产生具有不可忽视的作用。在口服后，中药的化学成分在肠内菌的作用下发生结构修饰，化学成分可以转化为有效成分或毒性成分。为了科学地揭示肠内菌对中药化学成分的修饰过程，笔者等根据多年的研究经验建立了《人肠内细菌生物转化模型和标准操作规程》。但是，由于肠内菌体外生物转化模型采用取自人肠道的混合菌丛，不同人的肠道菌丛可能存在差异，在培养过程中肠内菌也可能发生变异。这些是否影响肠内菌体外生物转化模型的稳定性，一直是人们所关注和争论的问题，为此，设计了本实验，对肠内菌体外生物转化模型的稳定性进行研究。
1 材料与仪器
1. 1 试剂与材料胰蛋白胨、牛肉膏、牛肝浸出粉、消化血清粉、大豆蛋白胨、朊胨和L-半胱氨酸盐酸盐、酵母浸膏、可溶性淀粉购自北京奥博星生物技术有限公司; 葡萄糖、磷酸二氢钾、氯化钠、氢氧化钠、硫代乙醇酸钠、活性炭( 均为分析纯) 购自北京化工厂; 变色硅胶购自青岛海洋化工厂; 乙腈( 色谱纯) 购自Fisher 公司( 美国) ; 重蒸馏水为自制。异槲皮素( 批号: 111809-201001 ) 、槲皮素( 批号:100081-200907) 对照品( 质量分数> 98%) 购自中国食品药品检定研究院。人肠内菌丛来自22 ～ 23 岁的4 名健康志愿者，2名男性，2名女性。
1. 2 仪器YQX-Ⅱ型厌氧培养箱( 上海新苗医疗器械制造有限公司) ; KQ-300VDE 型双频数控超声波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公司) ; AE240 十万分之一电子天平( 瑞士METTLER 公司) ; MLS-3780高压灭菌锅( 日本Sanyo 公司) ; CY-12C 型数字测氧仪( 浙江新安江分析仪器二厂) ; RCT basic 加热磁力搅拌器( 德国KIKA WERKE 公司) ; WATERS1525 高效液相色谱仪( 美国Waters 公司) 。
2 方法
2. 1 人肠内菌转化模型的建立
2. 1. 1 GAM 培养基的配制: A 液: 准确称取胰蛋白胨5 g、大豆蛋白胨1. 5 g、朊胨5 g、酵母浸膏2. 5 g、消化血清粉6. 75 g、牛肝浸出粉0. 6 g 和牛肉膏1. 1g，置于烧杯中，加适量重蒸馏水加热溶解。B 液: 准确称取葡萄糖1. 5 g、磷酸二氢钾1. 25 g、氯化钠1. 5g 和可溶性淀粉2. 5 g，置于烧杯中，加适量重蒸馏水加热溶解。C 液: 准确称取L-半胱氨酸盐酸盐0. 15 g 和硫代乙醇酸钠0. 15 g，置于100 mL 烧杯中，加适量重蒸馏水加热，超声溶解。
将A、B、C 三液混合，加重蒸馏水适量，直至完全溶解。在上述溶液中加入重蒸馏水至约490 mL，在电磁搅拌下，调节pH 至7. 2，再加重蒸馏水至500mL。取配制好的培养基200 mL，加入具塞三角瓶中，分装，高压蒸汽灭菌。
2. 1. 2 人肠内菌丛制备: 取自封袋，充满氮气，封口。装入志愿者的新鲜粪便，封口。用手挤压自封袋，使粪便均质化。在无菌操作条件下，取3 ～ 5 g粪便，放入已灭菌且装有培养基的具塞三角瓶中。置厌氧培养箱中，在37 ℃下培养24 h。从三角瓶中取出菌液1 mL，加至10 mL 螺口试管中并加9 mL培养基，封口膜密封，标记。在37 ℃活化培养24 h，取出，即为人肠内细菌混合菌丛，置于4 ℃ 冰箱保存。共制备4 个不同人源( CNJ1、CNJ2、CNJ3、CNJ4) 各3 代，共12 组人肠内菌混合菌丛。
2. 2 异槲皮素转化溶液的制备精密称取异槲皮素2. 1 mg，置于2 mL EP 管中，加150 μL DMSO 溶解，将其加至150 mL GAM 培养基中，混匀，4℃保存，备用。
2. 3 异槲皮素生物转化实验组分别加入异槲皮素转化溶液20 μL、菌液150 μL 和培养基3 mL。对照组以无菌水代替菌液，空白组以无菌水代替含药培养基。分别在厌氧条件下培养0、1、2、4、8、12、24、48 h。每组设3 个平行样。
2. 4 样品处理分别取转化后样品200 μL，置于1. 5 mL EP 管中，在4 ℃，14 800 rpm 离心15 min 除菌。取上清液150 μL，加入甲醇450 μL，混匀。再在4 ℃，14 800 rpm 离心15 min 除去蛋白。各取上清液500 μL，用于液相分析。
2. 5 HPLC 分析
2. 5. 1 色谱条件: Agilent TC C18色谱柱( 250 mm ×4. 6 mm，5 μm) ，带预柱; 柱温为35 ℃; 流动相为乙腈( A) -1%冰醋酸( B) ，梯度洗脱( 0 ～ 6 min，5% ～25% A; 6 ～ 17 min，25% ～ 100% A) ; 流速: 1. 0 mL /min; 检测波长: 340 nm; 进样量: 10 μL。
2. 5. 2 标准曲线的制备: 分别精密称取对照品异槲皮素10. 23 mg、槲皮素10. 07 mg，置于5 mL 量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，再分别稀释至1 /20浓度，得到异槲皮素和槲皮素对照品储备液。然后，将该储备液进行系列稀释，得到异槲皮素对照品溶液( 终浓度分别为0. 04092、0. 01023、0. 004092、0. 002046、0. 001023 mg /mL) 和槲皮素对照品溶液( 终浓度分别为0. 03224、0. 008056、0. 004028、0. 002014、0. 001007 mg /mL) ，用于标准曲线制备。采用”2. 5. 1″项下色谱条件，分别进样10 μL 异槲皮素和槲皮素对照品溶液，并以峰面积对浓度进行线性回归，得到异槲皮素的回归方程为Y1 = 6. 78 ×106X1 – 12052，r1 = 0. 9993，槲皮素回归方程为Y2 =5. 92 × 106X2 – 5778. 7，r2 = 0. 9998。
2. 5. 3 含量测定: 取处理后的每组样品，分别注入液相色谱仪，进样量均为10 μL。利用”2. 5. 1″项下色谱条件，进行液相色谱分析。根据标准曲线，采用峰面积计算各样品中异槲皮素和槲皮素的浓度。以每组异槲皮素和槲皮素的量对转化时间作图，得到不同人源和不同代数的异槲皮素转化时效曲线。
2. 5. 4 数据处理: 所有数据均用统计学软件SPSS17. 0 处理分析。统计学分析采用单因素方差分析和Kruskal-Wallis H 检验。
3 结果
3. 1 转化产物鉴定通过对异槲皮素转化后样品和槲皮素对照品的HPLC 图进行比较，发现异槲皮素( 10. 88 min) 的转化产物( 12. 87 min) 的保留时间和紫外光谱图与槲皮素一致，故确定异槲皮素的转化产物为异槲皮素脱糖基后产生的槲皮素。
3. 2 转化的时效关系样品的转化时效曲线见图2 ～ 4。各样品中异槲皮素的量随着转化时间的延长而减少，而槲皮素的量随着转化时间的延长而增多。不同人源的肠内菌丛均可在24 h 内将异槲皮素转化为槲皮素，但转化异槲皮素所用的时间存在差异，CNJ1、CNJ2、CNJ3 和CNJ4 人源的一代肠内菌完全转化异槲皮素分别需要12、8、6 和8 h。
3. 3 总转化效率根据各样品中异槲皮素和槲皮素的量计算肠内菌对异槲皮素的转化效率。经统计学分析，不同人源的肠内菌的转化效率差异的P 值均大于0. 05，说明差异无统计学意义，各样品的转化效率基本一致。然而，随着培养代数的增加，肠内菌的转化效率表现出增强的趋势，即与一代相比，二代和三代的转化效率增强，且多具有显著性差异( P < 0. 05 或P < 0. 01) 。
4 讨论与结论
本研究证明，不同人源的肠内菌均可将异槲皮素转化为槲皮素，只是转化所需的时间存在一定的差异。说明不同人源的肠内菌丛确实存在一定的个体差异，这可能与人饮食习惯、身体状况、生活规律等差异所造成的肠内菌丛差异有关，但是这种差异总体上不影响肠内菌转化模型的稳定性，特别是不影响化合物的定性转化研究的稳定性。在本研究的实验范围内，相同人源的肠内菌随着培养代数的增加表现出转化效率增强的趋势，说明肠内菌转化模型的建立需要一个达到稳态的过程，这可能与肠内菌丛内部的稳定过程，即细菌种类及其相对比例的稳定过程有关。这也提示，在建立标准操作规程时应该考虑将肠内菌的培养代数作为一个控制指标，进一步规范建立模型的操作规程，从而保证肠内菌转化研究的科学性。
中药由于其口服给药的特点，肠内菌对中药化学成分的转化研究具有十分重要的地位，而建立稳定可靠的肠内菌体外转化模型是研究中药化学成分肠内菌转化的关键。本研究的结果表明，按照前期制定的《标准操作规程》建立的肠内菌转化模型比较稳定，对中药化学成分的转化结果具有重现性，可用于中药的肠内菌转化研究。