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结核病(tuberculosis，TB)是由结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)感染引起的慢性传染病，是世界范围内危害最严重的传染病之一。MTB生长缓慢，感染后在人体巨噬细胞(Mφ)内存活，并可形成休眠菌而长期存在，TB临床治疗困难的主要原因。因此，了解MTB生物学和生理学特性，可为MTB的治疗和预防提供新的思路。
2008年发现了一种新的细菌小分子核苷酸类信号分子-c-di-AMP。研究发现，枯草杆菌DNA完整性检查蛋白(DNAintegrityscanningprotein，DisA)活化后，可催化2分子ATP分子合成1分子c-di-AMP，后者与下游相关蛋白相互作用，调节细菌生物过程。DisA是第一个c-di-AMP合成酶。随后从金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、李斯特假单胞菌等细菌中均发现c-di-AMP合成酶，该酶可调节细菌生长、细胞壁形成、芽胞形成、致病性和耐药性等多种生理过程。MTBRv3586编码具有c-di-AMP合成酶活性的DisA蛋白。本研究拟在大肠埃希菌(E.coli)中表达MTBDisA蛋白，并用纯化的蛋白制备小鼠多克隆抗体，为研究c-di-AMP调节MTB生理过程奠定了基础。
材料与方法
1材料
MTBH37Rv株购于中国药品生物制品检定所;卡介苗(BacillusCalmetteGuerin，BCG)ATCC(35734)标准株由本室保存。限制性内切酶、Taq酶、T4连接酶均购于(大连)Takara公司;预染蛋白分子Marker购于Fermentas公司;NiSepharose购于美国GE公司;BCA 蛋白质定量试剂盒购于德国ThermoScientificPierce公司;His单克隆抗体Novagen公司产品。HRP-羊抗小鼠及抗人IgG 购于北京中杉公司。
2方法
2.1目的基因的扩增根据GenBank公布的MTBH37Rv株的Rv3586编码基因序列设计表达C端His标签蛋白的引物。上游引物F1：5′-GCGCCATGGAGCACGCTGTGACTCGTCCGACC-3′(下划线为Nco Ⅰ 酶切位点);下游引物F2：5′-GCGAAGCTTTTGATCGCTGATGGTCGATTCC-3′(下划线为HindⅢ酶切位点，去除终止密码子)。引物由上海桑尼生物科技有限公司合成。以MTBH37Rv株基因组DNA 为模板PCR 扩增目的基因。反应体系(50μl)：基因组DNA0.5μl，F1引物0.5μl，F2引物0.5μl，dNTP4μl，Pfu多聚酶0.5μl，5×PfuBuffer10μl，H2O34μl。反应参数：95℃预变性5min，95℃变性30s，57℃复性30s，72℃延伸60s，共30个循环;72℃延伸10min。扩增产物以1%琼脂糖凝胶电泳分析，用凝胶回收试剂盒回收目的片段。
2.2原核表达载体的构建回收的目的基因片段用NcoⅠ和HindⅢ双酶切，1%琼脂糖凝胶电泳回收酶切产物，在T4DNA连接酶作用下与相同双酶切回收的pET28a+载体16 ℃连接过夜，连接产物转化E.coliDH5α感受态细胞，用卡那霉素(kan，25μg/ml)抗性平板筛选。挑取阳性克隆接种于卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，采用DNA试剂盒提取质粒DNA，提取物用NcoⅠ和HindⅢ限制性内切酶进行双酶切鉴定，用1%琼脂糖凝胶电泳分析后对重组质粒测序(由上海桑尼生物科技有限公司完成)。
2.3目的蛋白的诱导表达及鉴定取序列测定正确的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)，转化菌涂布于卡那霉素抗性的LB平板，37℃培养至菌落生成。挑取平板上单个菌落转入5ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，以1︰100的比例将过夜培养物转至新鲜含抗生素的LB液体培养基中，继续37℃振荡培养至A600值为0.6，加入IPTG至终浓度至1mmol/L，继续37℃培养4h。收集培养物，6000r/min(离心半径11cm)离心5min，收集菌体，经12%SDS-PAGE凝胶电泳后半干电转移至PVDF膜上，经5% BSA封闭后进行Westernblot。加入1︰1000抗His标签抗体稀释度为1︰1000或MTB感染小鼠血清，3二抗为HRP标记羊抗小鼠IgG，加入化学发光底物液显色，用BIO-RADChemiDocTMXRS化学发光荧光成像系统检测。
2.4目的蛋白的纯化将过夜培养物按照1︰100的比例转至200ml含卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养至A600值为0.6，加入IPTG至终浓度至0.1mmol/L，16℃过夜诱导目的蛋白表达。收集培养物，离心收集菌体沉淀。用30ml预冷的结合缓冲液A(50 mmol/LTris，150 mmol/LNaCl，10mmol/Limidazole，10% glycerol)重悬菌体沉淀。菌液在冰浴中超声，30%功率，间隔10s，共10min。然后于4℃以12000r/min(离心半径6.5cm)离心20min，取上清，加入结合缓冲液平衡后的层析柱中，用50ml洗涤缓冲液B(50mmol/LTris，150mmol/LNaCl，20mmol/Limidazole)洗涤，最后用洗涤缓冲液C(50mmol/LTris，150mmol/LNaCl，300mmol/Limidazole)洗脱目的蛋白，分段收集流出液。各收集管均取1μl样品，进行10% SDS-PAGE电泳分析。合并含有目的蛋白的流出液，于4℃用PBS透析，分装后于-80 ℃保存。纯化蛋白以BCA 法作定量分析。
2.5小鼠多抗血清的制备及测定用PBS将纯化蛋白调整浓度为1mg/ml，按照1︰1体积比与弗氏不完全佐剂混匀，背部皮下免疫6～8周龄雌性BALB/c小鼠，剂量0.1ml/只(50μg/只)，间隔2周，免疫3次。分别在免疫后2、4、6周采尾静脉血，采用ELISA法测定抗体滴度。免疫结束后4周，摘小鼠眼球法收集外周血，分离血清，-20 ℃保存，ELISA 法测定抗体滴度。纯化蛋白包被浓度为5μg/ml，免疫小鼠血清作倍比稀释，二抗为HRP标记羊抗小鼠IgG，底物为TMB，终止液为2mol/LH2SO4，用酶标仪测定A450值。试验以正常小鼠血清为阴性对照，实验组A450值/对照组A450值≥2.1判定为阳性。取MTBH37RV 和卡介苗(BCG)稳定期培养物各20ml，收集细菌沉淀，超声裂菌10min，12000r/min离心(离心半径6.5cm)收集上清，制备细菌蛋白，经12% SDS-PAGE 凝胶电泳后半干电转移至PVDF膜上，用5% BSA 封闭后按方法2.3 进行Westernblot(小鼠多抗血清稀释度为1︰1000)。
结果
1原核表达载体的构建
以MTBH37Rv毒株为模板，PCR 扩增Rv3586基因片段，1%琼脂糖凝胶电泳显示扩增片段为1077bp。PCR产物经NcoⅠ和HindⅢ双酶切后，与同样双酶切的原核表达载体pET28a+连接，转化E.coliDH5α感受态细胞，卡那霉素抗性LB平板筛选阳性。挑取阳性克隆扩增，提取质粒，限制性内切酶鉴定显示酶切目的片段为1077bp左右。对重组质粒测序，结果与GenBank公布序列一致。表明Rv3586原核表达载体构建成功，命名为pET-DisA。
2目的蛋白的诱导表达及鉴定
pET-DisA质粒转化BL21DE3后，经IPTG诱导表达，产物经SDS-PAGE鉴定分子质量单位约为43ku。经Western-blot鉴定，表达产物能被抗6×His单克隆抗体和感染小鼠血清识别，表明成功表达了DisA蛋白。
3目的蛋白的大量纯化
含有重组质粒pET-DisA 的E.coliBL21接种500mlLB培养基，Ni亲和层析法纯化可溶性目的蛋白，10%SDS-PAGE凝胶电泳显示分子质量单位约为43ku的纯化产物。PBS透析后，BCA 法测定蛋白浓度为1.7mg/ml，纯化蛋白得率为27.2mg/L培养物。
4多克隆血清的制备及鉴定
纯化的DisA 蛋白免疫小鼠1次后，ELISA 测定小鼠血清抗体滴度为1︰12800，免疫3次后抗体达到峰值。多克隆抗体滴度为1︰25600。Westernblot分析DisA 蛋白多抗血清可识别卡介苗和MTBH37Rv株的c-di-AMP合成酶。
讨论
研究表明，细菌通过调节环腺苷酸(cAMP)、鸟苷四磷酸(ppGpp)、环二鸟苷(c-di-GMP)和c-di-AMP等小分子核苷酸水平，调节包括细菌生长、营养摄取、细菌动力、生物被膜形成环及致病性等生理过程。c-di-AMP是近年来发现的细菌特有的信号分子。Witte等发现了第一个具有c-di-AMP合成酶活性的DisA蛋白，该蛋白具有一个可催化ATP合成c-di-AMP的二腺苷酸环化酶(Diadenylatecyclase，DAC)结构域(DUF147)和一个非特异的DNA结合域HhH结构域，两者由一个未知功能的结构域连接。同源序列分析表明，可催化ATP合成c-di-AMP的DAC结构域序列广泛分布在细菌及古细菌基因组中，而在真核细胞中未发现该结构域，因此c-di-AMP及其调节酶成为细菌性疾病疫苗和药物研究的新靶点。
Bai等报道MTB中Rv3586编码的蛋白具有DAC结构域，并具有二腺苷酸环化酶的活性，遂将其命名为Dac(后命名为DisA)蛋白。MTBRv3586基因共1077bp，编码相对分子量约为39ku的蛋白。本研究采用原核表达载体pET28a表达DisA蛋白，目的蛋白量占菌体蛋白总量的40%左右。由于重组蛋白C末端带有His标签，因此在SDS-PAGE电泳分析时，其相对分子质量约43ku。Westernblot分析显示重组蛋白可被His标签抗体及感染小鼠血清所识别，证实DisA 蛋白的表达。以纯化的重组蛋白免疫小鼠，单次免疫2周后即可测出高滴度的抗体，且持续时间长，表明该蛋白具有较强的免疫原性。
比较MTB和BCG中DisA蛋白编码序列仅有一个碱基的差别。用抗DisA 多克隆抗体检测MTB和BCG菌体蛋白，结果发现多克隆抗体可识别两种菌的DisA蛋白，但需要提高菌体蛋白浓度和延长化学发光检测时间才能获得反应结果，表明分枝杆菌中DisA表达量低，提示细菌在正常生理条件下表达的c-di-AMP水平不高，与其作为细菌信号分子的特性相一致。例如在枯草杆菌，c-di-AMP的水平降低则细菌芽胞形成受阻，而c-di-AMP 累积可使细菌卷曲、畸变。在MTB中已发现Rv2837c编码c-di-AMP分解酶，c-di-AMP在细菌内受精密调控，但其调控机制目前尚不清楚。本研究获得了均一度较好的重组cdi-AMP合成酶DisA蛋白，并制备了高滴度的多克隆抗体，为进一步研究c-di-AMP在MTB生物学和免疫学特性中的作用奠定了基础。