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　　食物过敏指的是某种特定食物进入人体后发生的一种特异性免疫反应。 据调查发现，在国内1983—1986 年期间，患有食物引起的过敏性疾病有184 例，其中将近1/4 是大豆引起的。 目前公布的8 大类过敏食物中，大豆蛋白是其中之一，人体吸收的植物蛋白很多来自大豆。 现在的食品加工业中有很多大豆制品，这给大豆敏感人群带来了不同程度的食品安全问题。 目前，避免发生大豆引起的过敏反应，有效的办法是尽量少食用大豆及大豆制品。

　　Gly m Bd 28K 是Cupin 蛋白家族中的一种，是低丰度蛋白，结构是一个普通的B-桶形，该家族是特征性保守序列，在Pfam 上的登录号为PF00190，且大多该家族成员具有过敏原性。 将近1/4 的大豆过敏患者血清中可以识别出Gly m Bd 28K，由此判定Gly m Bd 28K 是过敏原，并且是大豆中的主要过敏原之一。 最初从脱脂大豆粉的7S 球蛋白中分离得到了纯化的28K 天然蛋白，并以寡聚体的形式在植物体内存在，纯化后单体的分子质量和等电点分别为26 ku 和6。1，推测28K 单体的分子含220 个氨基酸残基。 目前国内对于大豆过敏原尤其是Gly m Bd 28K 的研究报道较少。 作者对Gly m Bd 28K 的基因进行了克隆表达、纯化，并制备了多抗血清，为研制大豆主要过敏原单克隆抗体和抗原结合表位的定位研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　T4-DNA ligase(M0202T):美国Biolabs 公司;2×pfu colorless mix (PER010 -1)、2 ×Taq PCR mix(PER008-1)、PCR 回收试剂盒(NEP024-1): 美国Sigma 公司;DH5α 感受态MCC001-1:北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司;MBP 载体由实验室改造所得。

　　1.2 仪器

　　SW-CJ-2D 超净工作台：苏州净化设备有限公司;DG2-CA 摇床：太仓市实验设备厂;TGL-21M 离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司;HW。SY11-K 恒温水浴锅：北京长风仪器仪表公司;WD-9413凝胶成像分析仪：北京六一仪器厂;3730 测序仪、9700 PCR 扩增仪器：美国ABI 公司。

　　1.3 方法

　　1.3.1 Gly m Bd 28K 基因的引物设计

　　根据NCBI Genbank 基因库中已经登录的大豆Gly m Bd 28K 基因序列，用Primer 5.0 设计引物对，引物序列为：297 bp -F：5′ -CGCGGATCCATGGGAAACAAAACTACCCTTTTG-3′ ;297 bp -R：5′ -CCGCTCGAGTCTACGGATGAATATGATGAGATTG-3′ 。在引物上下游的5′端分别插入一个BamHI、用XhoI 酶切位点。 该引物由上海生物工程公司合成，用去离子水配制成10 μmol/L。

　　1.3.2 Gly m Bd 28K 基因的PCR 扩增

　　以297 bp-F、297 bp-R 为引物，按照RT-PCR试剂盒操作手册对Gly m Bd 28K 基因进行RTPCR扩增。反应体系为：2×pfu colorless mix 为25 μL;Primer F(10 μmol/L) 为1 L;Primer R(10 μmol/L) 为1 μL;DNA 模板为2 μL。 加H2O 至50 μL。 反应过程：94 ℃预变性5 min;94 ℃变性30 s，57 ℃退火30s，72 ℃延伸1 min (35 个循环);72 ℃终延伸5min。 将RT-PCR 产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定，并回收目的片段。

　　1.3.3 目的基因与MBP 载体的连接与转化

　　将目的片段和MBP 载体连接，在T4 DNA 连接酶的作用下，4 ℃连接过夜，反应体系为:10 × T4DNA Ligase Buffer 为1 μL;MBP 载体为2 μL;目的基因回收产物为5 μL;T4 DNA Ligase 为1 μL。加去离子水至10 μL。 连接产物转化进大肠杆菌DH5α，涂板，经蓝、白斑筛选，挑取白斑，划线培养。

　　1.3.4 序列测定

　　选择酶切鉴定和PCR 鉴定后的阳性菌，将其送到上海生物工程公司进行测序。

　　1.3.5 重组蛋白的诱导表达

　　选择测序正确的克隆，在摇床上离心集菌，提取质粒，将阳性重组质粒转化BL21(DE3)表达宿主菌中，经过37 ℃ IPTG 诱导4 h 后，离心收集菌体，用PBS 对菌体进行洗涤，经超声波裂解后，分别取诱导前和诱导后的菌体，各加入上样缓冲液，经SDS-PAGE 来鉴定表达结果。

　　1.3.6 重组蛋白的纯化

　　离心收集菌体，将菌体重悬于缓冲液中，冻融后进行超声波破菌，然后离心收集上清液，用Ni-NTA 柱层析，收集含目标蛋白的洗脱组分，对其进行SDS-PAGE 分析鉴定。

　　1.3.7 Western blot 检测

　　Western blot 分析时，将SDS-PAGE 电泳分离的蛋白带电转到PVDF 蛋白印迹膜(polyvinylidenefluoride，Millipore)，用5%脱脂奶粉37 ℃封闭1 h，以Tris 洗涤缓冲液(1.5 μmol/L NaCl、10 mμmol/LTris-HCl pH 7.4、0.02% Tween 20，TBST) 充分洗涤，加0.5 g/mL Anti-Gly m Bd 28K pAb(实验室保存的抗天然Gly m Bd 28K 蛋白的多抗血清)，37 ℃孵育1 h，用TBST 洗涤后，加0.5 g/mL HRP 标记兔抗小鼠IgG 抗体(KPL)，37 ℃作用1 h，TBST 充分洗涤，以3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)为底物显色。

　　1.3.8 Gly m Bd 28K 多抗血清的制备

　　纯化后的Gly m Bd 28K 蛋白免疫新西兰大白兔，免疫前耳缘静脉取血，离心收集阴性对照血清，-20 ℃保存。 将Gly m Bd 28K 蛋白用无菌去离子水稀释至浓度1 mg/mL，分装-20 ℃保存;免疫时取300 μL 抗原，与等体积的弗氏完全佐剂充分乳化后，对兔子进行背部皮下多点注射，每只注射1 mL 抗原乳剂。 14 d 后300 μL 抗原与等体积的弗氏不完全佐剂充分乳化，同样方法加强免疫，之后每10 d 加强一次，共免疫4 次，最后一次不含佐剂加倍抗原耳缘静脉注射，3 d 后心脏采血，收集离心血清，分装后-20 ℃下保存。

　　1.3.9 Gly m Bd 28K 多抗血清效价的测定

　　将Gly m Bd 28K 蛋白稀释为1 μg/mL 包被ELISA 板，4 ℃过夜孵育。 倒空孔内液体，用洗涤液洗涤3 次。 各孔加入300 μL 封闭液，37 ℃孵育1 h。 用洗涤液洗涤3 次，留取一个孔加入100 μLPBS(0.01 mol/L pH 7.4 磷酸盐缓冲液)作空白对照，另外一个孔加入100 μL 免疫前兔血清作阴性对照，其余各孔加入100 μL 倍比稀释的兔抗血清(1∶(1.6×103~1.6×106);2 倍的倍比稀释)，37 ℃孵育1h。 洗涤后每孔加入100 μL 稀释的山羊抗兔IgGHRP(1∶1 000 稀释)，作为二抗，37 ℃下孵育30min，先用洗涤液洗涤3 次，再用洗涤液浸泡5min，最后再洗涤3 次，每孔中加100 μL TMB 单组分显色液，避光显色10 min。 每孔中加50 μL 2mol/L H2SO4终止液，终止反应，然后立即在酶标仪450 nm 处读数，以与大豆主要过敏原Gly m Bd28K 蛋白抗原发生反应的多克隆抗体的最大稀释度为其效价，P/N≥2.1 则为阳性。

　　2 结果与分析

　　2.1 RT-PCR 产物电泳分析

　　设计引物以大豆cDNA 为模板扩增大豆Glym Bd 28K 基因序列，经1%琼脂糖凝胶电泳后，在297 bp 左右有一特异条带，大小与预期的相符。

　　2.2 序列分析

　　克隆得到大豆Gly m Bd 28K 基因，是由297个碱基组成，其中的开放阅读框含有297 bp。 推导出核酸序列，并编码了99 个氨基酸。 通过分析计算，推测该蛋白质的相对分子质量为11 263.25，等电点为9.73。 具体序列见图2。利用NCBI 中的BLAST，对测序得到的序列进行序列比对，并推导出与其相对应的氨基酸序列，随后将其与数据库中已知的大豆Gly m Bd 28K 基因的氨基酸序列进行比对，分析其序列同源性。 结果显示：克隆的Gly m Bd 28K 基因与数据库中已知的大豆Gly m Bd 28K 基因同源性为100%(LOC547942)。 说明此次所得克隆是大豆的Gly m Bd 28K 基因。

　　2.3 表达蛋白的SDS -PAGE 鉴定和Westermblot 分析

　　将鉴定为阳性的重组表达质粒转入到BL 21(DE3) 表达宿主菌中进行诱导表达。 37 ℃经IPTG诱导过夜获得重组的蛋白，采用Ni-NTA 柱亲和层析的方法纯化重组蛋白，收集峰液，进行SDSPAGE鉴定。用兔抗Gly m Bd 28K 的血清与His-MBP-297菌体蛋白进行Western blot 分析。 结果显示，表达产物与兔抗Gly m Bd 28K 血清阳性血清发生反应，于56 000 处出现一个清晰的反应条带，这表明重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达，并保留了免疫原性。由图4 可知，在相对分子质量56 000 左右处有外源蛋白表达条带出现，蛋白分子质量与预期结果相符。

　　2.4 兔抗Gly m Bd 28K 血清效价的测定结果

　　经ELISA 测定用Gly m Bd 28K 所免疫的两只新西兰大白兔均产生相应的抗体，并且抗体的效价随着免疫的加强而增加，最终抗体的效价高达1∶1。6×106 以上。

　　3 讨论

　　食物过敏反应对现在的人来说，是一种很常见的自身免疫性疾病，这类疾病的复发率通常很高，且这类疾病的发生与遗传和环境有很大的关系。 尤其是当代生活给人们带来的压力很大，这也是食物过敏重要诱因之一。 人类身体所需要的蛋白质大部分来源于植物蛋白，而来自于大豆中的蛋白占了16%。

　　该研究通过数据库中已知的大豆序列，首先设计出一对引物，进而克隆出Gly m Bd 28K 基因，由297 个碱基对组成，其中开放阅读框由297 bp组成，编码的氨基酸个数为99 个。 该序列编码的蛋白质相对分子质量为11 263.25，等电点为9.73。 通过序列分析发现，与数据库中已知的大豆Gly mBd 28K 基因相比，同源性为100%(LOC547942)。试验过程中用MBP 载体进行目的蛋白Gly m Bd28K 的表达，并在BL 21(DE3)表达宿主菌中得到高效表达，Ni-NTA 柱进行层析获得高纯度的Gly mBd 28K 蛋白，并通过Western blot 分析，进一步确定重组蛋白在大肠杆菌中得到了正确表达。 用纯化的重组蛋白免疫新西兰大白兔，获得了效价高达1∶1.6×106 的兔多抗血清。 该试验与刘宾等的研究相比，只克隆表达了Gly m Bd 28K 蛋白的部分片段。 这些研究为以后的研究做基础，以后将用合成出来的蛋白制备Gly m Bd 28K 的单克隆抗体，进而确定出Gly m Bd 28K 的抗原结合表位。

　　基于生物语言学角度浅析语言与大脑、思维间的关系

　　”生物语言学”这一术语的诞生可以追溯到1959年克拉仁斯和穆世肯出版的《生物语言学手册》。在生物语言学领域，研究较深的当属乔姆斯基，他认为语言能力就像人的视觉能力一样，最终可以归结为生理和物理状态。我们了解到人类在历经几百万年的时间进化过程中，进化发育到现在具有学习几千种语言中任何一种语言的能力。我们可以认为语言的进化发展是随着我们大脑容量的增大而产生的一种能力。人类语言具有典型的生物性，同时也是进行心理表达的工具。我们知道，人脑也是思维的器官，而思维的时候需要运用语言。

　　因此，语言与大脑、思维之间有着密不可分的关系，接下来从生物语言学的角度出发探讨大脑、语言和思维的关系。

　　1. 生物语言学的定义

　　生物语言学是生物研究和语言研究所形成的交叉学科，有广义的定义和狭义的定义。

　　狭义的生物语言学定义主要是指以乔姆斯基为代表的生成语法学派关于语法属性的研究，乔姆斯基把语言官能视为人脑的一个与生俱来的生物器官。而广义的定义是指，生物语言学研究包括了进化生物学、基因科学、神经科学以及心理学等多学科方向进行的语言研究，甚至研究了语言的生理基础。我们发现国内外的百科全书、词典和工具资料书等对生物语言学的定义更偏向于生物语言学广义的定义，而站在学术论文分析的角度，生物语言学研究更关注狭义生物语言学内容，本文倾向于后者。

　　2. 语言是指什么

　　我们将语言和生物形式作比较，语言也有发展和衰败的过程。动物和植物通过自然选择来保持良种，适应性好的变种往往易于保存下来，反之适应性不好的变种则避免不了衰落，语言和语言之间互相接触互相排斥，不同的语言之间的相互影响、相互渗透，就像动物和动物之间因为种种原因产生的竞争，适应性好的语言易于保存下来，适应性不好的语言则会逐渐衰亡。

　　在交际过程中，我们运用语言往往是一瞬间的事，同时却包含了很多其他复杂的问题。我们要真正认识语言，则需要很多其他的学科配合，不仅仅是语言学所能独立完成的。每个学科都喜欢从自己关心并感兴趣的角度来研究语言，例如生物学研究语言发音的生理基础，物理学研究研究语言过程中的物理现象，病理学通过研究一系列语言现象判断和治疗失语症等等。这些学科的研究无疑会促进对语言的全面认识，我们主要讨论一下生物学对语言所带来的影响。

　　3. 思维是什么

　　我们可以认为思维是一种特殊物质运动的产物，这种物质运动可以派生和表现为意识活动。不妨把人类意识活动大致归为以下几个层次：

　　3.1本能行为的反应

　　人每时每刻都在这层次活动并做出反应，人与人之间生物体物质组织的不同决定着由自身内部运动以及所产生出的行为表现形式的不同，即本能行为的反应不同。

　　3.2广义的学习过程

　　日常生活中，我们先捕捉到大量外界信息，然后有目的性或无目的性的接收并进行加工，最后分类储存在大脑内，这包括了人类广义的学习过程，这一过程扩展了人们对所处的客观世界的认识。

　　3.3最高层次的思维功能

　　人的意识和行为随着自身物质组织的变化而变化，人这种生物体的各个物质器官都会随着自身的发育、成熟、衰老、病变、受损以及受到外界刺激而变化，在它们发生变化时，其行为方式也会随之变化。人的意识有选择地对大脑皮层中的信息进行提取，然后对这些信息进行组织和加工、推理和演绎，形成一定的概念等等，即最高层次的思维功能。

　　4. 语言和大脑以及思维之间的关系

　　语言的产生无法离开适当的语言器官，语言器官包括发音器官，听觉器官还有大脑，这三个环节是保证语言发育的先决条件，接下来我们主要讨论大脑所带来的影响。

　　婴儿出生后，就处于一个现成的语言环境，需要花很长一段时间学习周围的语言，学习说话的过程也就是认识他所处的这个世界的过程，是他自身思维发展的一个过程。婴儿在看见周围的事物并尝试用语言进行表达时，必定会犯一些错误，大人在进行纠正时，也会促使孩子注意分辨并进行思考，这个过程锻炼了孩子的思维能力。儿童进行语言的学习是离不开外界的社会条件的，例如狼孩没有正常的语言环境，大脑的语言潜能没有被充分地开发。在人类进化过程中，直立姿势使头颅托置于脊柱上，促进大脑发育，大脑发育后形成的新的组织和语言行为有一定的关系。人类大脑的两个半球具有不同的功能，对于左右脑分工的研究已有一百多年的历史，大脑的左半球控制了语言功能及相关的计数、推理等功能，而大脑的右半球则在音乐等艺术感知、内在想象力等方面起着重要的作用，人脑的左右两半球是有一定的分工的，这为语言的产生提供了一定的生理基础。

　　结语

　　语言学与生物学的相似之处虽然提出的时间比较早，但是在现今的语言研究当中仍然会提及，语言中的生物观得到了完整的体现。

　　内在的语言是一种心理活动，而思维在一定程度上也是依托于语言所存在的，我们在思考时会伴随一定的语言应用，而语言所带来的不同在很大程度生也会导致思维方式的不一致。思维是人类大脑所具有的功能，大脑的生理构造并没有差异，因而大脑的功能也没有差异，全人类都是一样的。由此我们从生物语言学角度可以认识到语言的生物性，以及语言和大脑、语言和思维之间密不可分的关系。